程序性死亡配體1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用

湯國軍，胡叢崗，童骎，姚葉鋒，楊偉東

（1. 浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，浙江 金華 321000；2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，麻醉科 浙江 鄞州 315100）

結(jié)直腸癌的治療方式主要以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔助放化療及免疫治療等，隨著手術(shù)方式的改進(jìn)、放射治療及化療藥物種類的增多，及免疫治療藥物的研發(fā)，使結(jié)直腸癌的治療取得巨大進(jìn)步[1-2]，但由于結(jié)直腸癌缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，使多數(shù)結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為結(jié)直腸癌晚期，錯(cuò)過了手術(shù)時(shí)機(jī)，預(yù)后比較差；對(duì)于結(jié)直腸晚期患者的治療主要依賴分子靶向藥物治療和細(xì)胞因子制劑治療[3-4]，但結(jié)直腸癌的5年生存率仍比較低， 因此研究結(jié)直腸癌發(fā)病過程中的關(guān)鍵性分析對(duì)結(jié)直腸癌患者的診治及開發(fā)新的分子靶向藥物具有重要意義。程序性死亡配體1（PD-L1）在免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，和多種惡性腫瘤的預(yù)后和惡性程度有關(guān)[5-8]。本文對(duì)結(jié)直腸癌組織中PD-L1的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本與細(xì)胞株

收集浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院胃腸外科病理證實(shí)的結(jié)直腸癌標(biāo)本100例、癌旁組織標(biāo)本100例、結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本100例和正常結(jié)直腸組織標(biāo)本100例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患其它部位原發(fā)惡性腫瘤者，消化道相關(guān)淋巴瘤者，手術(shù)前進(jìn)行過放療或化療者，拒絕參與研究者。所有研究對(duì)象簽署知情同意書，經(jīng)浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自美國ATCC公司；兔抗人PD-L1單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒購自英國ABCAM公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè) 將上述結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、癌旁組織和正常結(jié)直腸組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)石蠟切片標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)SP法測(cè)定各結(jié)直腸組織中PD-L1含量，一抗為兔抗人PD-L1單克隆抗體，陰性對(duì)照一抗以PBS液代替，細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色染色為PD-L1陽性細(xì)胞。

1.2.2 PD-L1干擾載體制備 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)和合成PD-L1 siRNA，并設(shè)計(jì)與人類基因沒有同源性的siRNA作為陰性對(duì)照序列。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將HCT116細(xì)胞分為3組：PDL1 siRNA組（轉(zhuǎn)染PD-L1 siRNA）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）、空白對(duì)照組（不進(jìn)行轉(zhuǎn)染）。

1.2.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長良好的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種到6孔板中，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行干擾效率檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法測(cè)定各組結(jié)直腸癌細(xì)胞中PD-L1蛋白的表達(dá)情況：提取各組結(jié)直腸癌細(xì)胞總蛋白質(zhì)，進(jìn)行蛋白電泳，對(duì)實(shí)驗(yàn)條帶進(jìn)行拍照觀察，采用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算各組細(xì)胞中PD-L1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 直腸癌細(xì)胞增殖檢測(cè) 胰蛋白酶消化生長良好的的各組結(jié)直腸癌制成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，采用MTT法測(cè)定各組結(jié)直腸癌細(xì)胞7 d內(nèi)的生長情況，酶標(biāo)儀測(cè)定波長490 nm處吸光度值，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖情況以波長490 nm處的吸光度值表示。

圖1 PD-L1免疫組化染色（×200） A：結(jié)直腸癌組織中PD-L1陽性表達(dá)；B：結(jié)直腸腺瘤組織中PD-L1陽性表達(dá)；C：癌旁組織中PD-L1陽性表達(dá)；D：正常結(jié)直腸組織中PD-L1陰性表達(dá)

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，采用流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定各組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將各組結(jié)直腸癌細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，采用Transwell法測(cè)定各組細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，PD-L1在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、癌旁組織、正常結(jié)直腸組織中的陽性表達(dá)率分別為45.0%、33.0%、10.0%、0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）（表1）。

表1 各組標(biāo)本中PD-L1的陽性表達(dá)率[n=100，n（%）]

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 A：各組PD-L1表達(dá)水平；B：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間

2.2 siRNA PD-L1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中PD-L1的干擾效率

Western blot檢測(cè)siRNA PD-L1對(duì)HCT116細(xì)胞中PD-L1的干擾效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)明顯降低，轉(zhuǎn)染后2 d對(duì)HCT116細(xì)胞中PD-L1的干擾效率最高（圖2）。

2.3 siRNA PD-L1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞第1天OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第3、7天，siRNA PD-L1組結(jié)直腸癌細(xì)胞OD值低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組結(jié)直腸癌細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。

表2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞OD值比較（±s）

表2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞OD值比較（±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 第1天 第3天 第7天空白對(duì)照組 0.513±0.121 1.585±0.194 2.416±0.231陰性對(duì)照組 0.505±0.114 1.523±0.187 2.321±0.232 siRNA PD-L1 組 0.497±0.102 1.242±0.1781), 2)1.532±0.1921), 2)F 0.325 4.636 30.245 P 0.921 0.021 0.000

2.4 siRNA PD-L1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

siRNA PD-L1組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

2.5 siRNA PD-L1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

siRNA PD-L1組侵襲細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率（%，±s）

表3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率（%，±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組 0.98±0.04陰性對(duì)照組 1.03±0.03 siRNA PD-L1 組 15.46±5.31), 2)F 63.142 P 0.000

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)，±s）

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)，±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組 236.47±18.21陰性對(duì)照組 225.35±17.58 siRNA PD-L1 組 112.43±12.641), 2)F 125.47 P 0.000

3 討 論

3.1 PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況

PD-L1是B7家族成員，是程序性死亡分子1的配體，在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞中廣泛表達(dá)，PD-L1在上述細(xì)胞上的表達(dá)受到干擾素-γ的刺激后進(jìn)一步升高[9-11]；提呈抗原細(xì)胞表面的PD-L1分子和T細(xì)胞表面的程序性死亡分子-1結(jié)合發(fā)揮作用[9-10]，在免疫耐受的誘導(dǎo)和維持方面具有重要作用[11-14]；PD-L1在多種惡性腫瘤細(xì)胞中也有異常表達(dá)[15-16]，和惡性腫瘤細(xì)胞的預(yù)后和惡性程度有關(guān)，和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞關(guān)系密切，PD-L1和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表達(dá)的程序性死亡分子1結(jié)合，從而對(duì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的功能產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[17-19]。沈吟芳等[20]研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中PD-L1表達(dá)顯著升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤也明顯升高，肺癌組織中PD-L1水平和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤為正相關(guān)關(guān)系，梁姣姣等[21]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和PD-L1的升高可能是促進(jìn)結(jié)腸癌免疫逃逸得重要因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PD-L1在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌旁組織細(xì)胞胞漿和胞膜中有表達(dá)，在正常結(jié)直腸組織中無PD-L1表達(dá)。結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸腺瘤組織中PD-L1陽性表達(dá)率高于正常結(jié)直腸組織，結(jié)直腸癌組織中PD-L1陽性表達(dá)率高于結(jié)直腸腺瘤組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)直腸腺瘤被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的癌前病變，結(jié)直腸癌的發(fā)生經(jīng)過結(jié)直腸腺瘤期，考慮PD-L1陽性在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

3.2 PD-L1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后2 d對(duì)HCT116細(xì)胞中PD-L1的干擾效率最高；第3、7天，siRNA PD-L1組細(xì)胞OD值低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；siRNA PD-L1組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；siRNA PD-L1組侵襲細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明下調(diào)HCT116細(xì)胞中的PD-L1水平，可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖，促進(jìn)結(jié)凋亡，抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。在結(jié)直腸癌組織中，PD-L1呈高表達(dá)，PD-L1水平的升高可能通過促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。PD-L1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能不只作為程序性死亡分子1的配體，還可能抑制受體傳遞信號(hào)的作用，對(duì)腫瘤浸潤T細(xì)胞的殺傷功能產(chǎn)生抑制，增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中PD-L1水平升高，下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平可以對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響，使結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度降低。

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