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    癌組織中CD45RO表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征及生存率的關(guān)聯(lián)分析

    2018-07-07 07:28:10俞達(dá)輝吳道立袁沖褚文炎
    關(guān)鍵詞:腺癌淋巴結(jié)病理

    俞達(dá)輝,吳道立,袁沖,褚文炎

    (余姚市人民醫(yī)院心胸外科,浙江 余姚 315400)

    肺癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。肺腺癌是其最常見的組織學(xué)亞型[1]。隨著手術(shù)治療、放化療、靶向治療以及免疫治療等多種治療手段的應(yīng)用和發(fā)展,肺腺癌患者的療效有所提高,但其5年總生存率仍然為4%~17%[2]。

    腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 (tumor-infiltrating lymphocyte,TILs) 作為一類由不同細(xì)胞構(gòu)成的異質(zhì)細(xì)胞群,可浸入腫瘤組織直接反映宿主與腫瘤之間的免疫應(yīng)答狀態(tài)[3]。CD45分子,即蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶受體C型,可作為T淋巴細(xì)胞亞群的分類標(biāo)志。CD45RO+記憶T細(xì)胞是較常見的T細(xì)胞亞型,有強(qiáng)大的自我更新能力,可在再次接觸抗原后產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,從而在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著重要作用[4]。然而,關(guān)于CD45RO表達(dá)水平在肺腺癌患者中的作用目前尚不明確。因此,本研究旨在評估腫瘤組織CD45RO表達(dá)水平與肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    本研究為前瞻性隊列研究設(shè)計,連續(xù)納入了121例2009年3月至2012年2月于余姚市人民醫(yī)院心胸外科接受開胸手術(shù)治療的肺腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為: (1) 所有患者均根據(jù)其臨床特征、影像學(xué)檢查和病理證實確診為肺腺癌; (2) 所有患者術(shù)前未進(jìn)行任何新輔助治療 (包括新輔助化療、放療等),且均接受了肺部手術(shù)治療; (3) 所有患者年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn): (1) 有嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝功能異常或嚴(yán)重腎功能異?;颊?,合并其他惡性腫瘤的患者或有其他惡性腫瘤史的患者; (2) 預(yù)期生命值<12個月患者; (3)有認(rèn)知障礙或其他因素導(dǎo)致預(yù)估難以執(zhí)行定期隨訪和評估的患者。本研究經(jīng)過余姚市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均簽署了知情同意書。手術(shù)中采集肺腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本,然后采用福爾馬林浸泡并石蠟封存以備后期使用。

    1.2 臨床病理特征采集和隨訪

    采集所有患者的基線期人口學(xué)、臨床和病理特征信息 (包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和TNM分期) ,按照第6版AJCC腫瘤分期手冊進(jìn)行TNM分期評估。所有患者手術(shù)后均接受輔助化療:長春瑞濱25 mg/m2d1和d8,順鉑75 mg/m2d1,q3w 治療3~4個療程。隨訪截止日期為2017年2月,中位隨訪期為44個月?;颊咝g(shù)后6個月每月隨訪1次;6個月到2年每3月隨訪1次;之后每6月隨訪1次。無病生存期 (disease free survival,DFS)和總體生存期 (overall survival,OS) 是根據(jù)患者疾病復(fù)發(fā)、死亡和/或最終隨訪時間計算的。

    1.3 免疫組化

    采用anti-CD45RO抗體 (Abcam) 對組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色: (1) 對石蠟切片進(jìn)行脫蠟;加入修復(fù)液Tris-EDTA (pH = 9.0) 進(jìn)行抗原修復(fù);加入3%的過氧化氫溶液進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷;將其浸入4%牛血清白蛋白進(jìn)行非特異性內(nèi)源性抗原的阻斷。 (2) 加入anti-CD45RO抗體,同時將其置于4℃冰箱里孵育過夜;洗后,加入辣根過氧化物酶 (合)共軛anti-IgG (Abcam) 對其再次進(jìn)行孵育,同時室溫靜置30 min。 (3) 清洗和DAB處理;加樣器加入蘇木精進(jìn)行復(fù)染。 (4) 脫水,封片。

    2位病理科醫(yī)師采用雙盲法分別利用光學(xué)顯微鏡對其陽性細(xì)胞進(jìn)行觀察閱片。每張切片隨機(jī)觀察視野腫瘤細(xì)胞,計算100個細(xì)胞/視野染色陽性的細(xì)胞比,在高倍鏡視野下 (高通濾波器,400倍) 。陽性細(xì)胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)為:0分 (0%) 、1分(>0%~25%) 、2分 (>25%~50%) 、3分 (>50%~75%) 和4分 (>75%~100%) 。CD45RO以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性,染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):基本不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。最后,計算染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和染色面積分?jǐn)?shù)的乘積得到總表達(dá)評分,并進(jìn)行分組:低 (0~3分) 、中 (4~6分) 、高 (> 6分) 。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)展示形式主要為±s和百分比表示。采用χ2檢驗比較肺腺癌組織和癌旁組織CD45RO表達(dá)水平差異;采用Pearson檢驗分析肺腺癌組織CD45RO水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián);采用Kaplan-Meier (K-M) 曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)與DFS及OS的關(guān)聯(lián);采用單因素和多因素COX風(fēng)險比回歸模型進(jìn)行基線期因素對于DFS及OS的預(yù)測作用分析。P> 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 基線期信息

    本研究納入121例肺腺癌手術(shù)患者,其中男69例、女52例;平均年齡 (62.97±9.87) 歲;腫瘤大小≤5 cm 68例 (56.2%) 、>5 cm 53例 (43.8%) ;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者71例 (58.7%) 、陽性50例 (41.3%) ;遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移陰性患者119例 (98.3%) 、陽性2例 (1.7%) 。見表1。

    2.2 CD45RO在肺腺癌組織中高表達(dá)

    表1 肺腺癌患者基線期信息Tab.1 Baseline characteristics in surgical patients with LAC

    免疫組織化學(xué)染色顯示,CD45RO相對于癌旁組織在肺腺癌組織中高表達(dá),見圖1,表2。肺腺癌組織和癌旁組織中高、中、低表達(dá)CD45RO在肺腺癌組織中的數(shù)量分別為82、68、30,然而其表達(dá)在癌旁組織中的數(shù)量分別為17、59、104;2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P< 0.001) ,見表2。

    圖1 免疫組化顯示CD45RO在肺腺癌組織中高表達(dá)Fig.1 High CD45RO expression in tumor tissue samples

    2.3 肺腺癌組織中CD45RO表達(dá)水平與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)

    腫瘤組織CD45RO表達(dá)水平與腫瘤大小 (r=-0.198,P= 0.029) 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (r= -0.184,P= 0.043)均呈負(fù)相關(guān)。見表2。

    2.4 肺腺癌組織中CD45RO表達(dá)水平與DFS及OS的關(guān)聯(lián)

    采用K-M曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)與DFS及OS的關(guān)聯(lián),結(jié)果顯示肺腺癌組織中的CD45RO表達(dá)水平越高,DFS (P< 0.001)和OS (P< 0.001) 越長,見圖2。

    2.5 肺腺癌患者DFS和OS的預(yù)后因素分析

    采用單因素COX風(fēng)險回歸模型分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)水平以及臨床病理特征分別對于其手術(shù)患者DFS和OS影響,顯示腫瘤組織CD45RO表達(dá)量與患者較好的DFS顯著相關(guān) (P< 0.001) 。然而,低分化 (P= 0.046) 、淋巴轉(zhuǎn)移 (P< 0.001) 及TNM分級 (P= 0.003) 與患者較差的DFS顯著相關(guān)。進(jìn)一步采用多因素COX回歸模型分析肺腺癌手術(shù)患者DFS的獨立預(yù)測因素,發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量(P< 0.001) 能獨立預(yù)測其患者良好的DFS,然而,低分化 (P= 0.017) 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P= 0.004) 均能獨立預(yù)測肺腺癌手術(shù)患者不良的DFS。見表3。

    表2 CD45RO表達(dá)水平和患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)Tab.2 Correlation of CD45RO expression with clinicopathological properties

    圖2 CD45RO表達(dá)水平與DFS以及OS的Kaplan-Meier曲線分析Fig.2 Kaplan-Meier curve for Correlations of CD45RO expression with DFS and OS

    表3 肺腺癌患者DFS預(yù)后因素分析Tab.3 Analysis of predictive factors for DFS in patients with LAC

    單因素COX分析發(fā)現(xiàn),肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量與患者較好的OS (P< 0.001) 有關(guān),而低分化(P= 0.003) 、淋巴轉(zhuǎn)移 (P< 0.001) 、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 (P=0.029) 及TNM分級 (P= 0.001) 均與患者較差的OS有關(guān)。多因素COX分析結(jié)果顯示,肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量 (P< 0.001) 能獨立預(yù)測其手術(shù)患者良好的OS,而低分化 (P= 0.001) 、淋巴轉(zhuǎn)移 (P< 0.001) 及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 (P= 0.001) 均能獨立預(yù)測其手術(shù)患者較差的OS。其他臨床病理特征對OS的預(yù)測作用,見表4。

    表4 肺腺癌患者OS預(yù)后因素分析Tab.4 Analysis of predictive factors for OS in patients with LAC

    3 討論

    多種TILs,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞以及樹突細(xì)胞等,可通過特異性識別和清除機(jī)體腫瘤細(xì)胞,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[5]。其中CD45RO+TILs被發(fā)現(xiàn)在胃癌以及喉癌中呈高表達(dá)水平[4,6]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為腫瘤發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),腫瘤微環(huán)境中存在大量的白細(xì)胞,從而在所有白細(xì)胞上均有表達(dá),且也稱為白細(xì)胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA) 的CD45被更多的發(fā)現(xiàn)[7]。

    CD45是一類結(jié)構(gòu)相似的跨膜蛋白組成的分子,由PRPRC基因編碼[8]。CD45RO記憶T細(xì)胞再次接觸到腫瘤細(xì)胞時,可快速發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),繼而殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。研究[9]表明,CD45RO通過激活白細(xì)胞介素2 (interleukin-2,IL-2) 、干擾素γ (interferon-γ,IFN-γ) 以及腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α) 來抵抗宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移,繼而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。同時,CD45RO+記憶T細(xì)胞減少高遷移率族蛋白B1 (high-mobility group box 1,HMGB1) 的生成,抑制晚期結(jié)腸癌患者腫瘤細(xì)胞增殖分化和遷徙[10]。此外,CD45RO+TILs的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌患者的低分化和TMN分級、乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小、結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血管侵襲均呈負(fù)相關(guān)[11-13]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn),這可能是由于CD45RO可調(diào)節(jié)多種效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,發(fā)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答來殺傷腫瘤細(xì)胞從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[9-10]。

    一些研究[14]評估了CD45RO與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。乳腺癌患者中CD45RO高表達(dá)組的腫瘤復(fù)發(fā)率低于低表達(dá)組。且CD45RO高表達(dá)水平已被證實與腎細(xì)胞癌以及胃癌患者良好的DFS和OS均密切相關(guān)[12,15]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為CD45RO能促進(jìn)大量效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌,產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,殺傷腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,繼而影響患者的預(yù)后情況[9-10]。

    本研究仍有有一些不足: (1) 主要納入了可接受肺腺癌手術(shù)的Ⅰ~Ⅲ期的患者 (Ⅳ期患者僅2例),因此CD45RO表達(dá)水平在肺腺癌Ⅳ期患者的預(yù)后作用尚不明確; (2) 對肺腺癌患者組織樣本CD45RO的表達(dá)量進(jìn)行了鑒定,而未對血液中CD45RO表達(dá)量進(jìn)行評估; (3) 樣本量相對較小。故進(jìn)一步的研究需要擴(kuò)大樣本容量并且同時納入肺腺癌Ⅳ期患者且采集患者血液樣本。

    綜上所述,本研究表明,腫瘤組織中CD45RO表達(dá)水平可作為新穎且可靠的生物標(biāo)志物,用于評估肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理特征和預(yù)后情況。

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