茜草炭復合提取物對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及內(nèi)膜組織VEGF、NF-κB的影響

賈曉慧，侴 琳，周曉麗

0 引言

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMT)是指有活性的內(nèi)膜細胞種植在宮腔以外的位置而形成的一種育齡期婦女常見的雌激素依賴性疾病[1]。其主要病理變化為異位內(nèi)膜周期性出血及其周圍組織纖維化，形成異位結節(jié)，導致痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)異常和不孕等癥，因其病因不明確、易復發(fā)、難以根治等現(xiàn)狀，嚴重威脅女性健康和生活質(zhì)量。目前臨床治療手段主要為頻繁手術治療或長期藥物治療，但如何克服手術易復發(fā)、藥物長期服用不良反應大等缺點，成為現(xiàn)今治療子宮內(nèi)膜異位癥研究的熱點和難點。中醫(yī)研究認為，子宮內(nèi)膜異位癥的基本病機是血瘀，即“血瘀日久，蘊久化毒、瘀毒傷絡”，進而導致機體微循環(huán)及血液動力學的改變，中醫(yī)藥治療針對其病機本質(zhì)進行活血化瘀論治[2-3]。研究表明，異位內(nèi)膜的病變可影響在位內(nèi)膜細胞的增殖、凋亡及內(nèi)膜組織中相關因子(如VEGF、NF-κB)的表達異常,從而促進EMT的發(fā)生和發(fā)展，即在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜二者病灶之間相互影響，表明改善在位或異位的病理狀態(tài)均有助于控制EMT的發(fā)展[4-5]。本文通過研究單味中藥茜草炭的復合提取物對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及內(nèi)膜組織中VEGF、NF-κB表達的影響，闡述其治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制，為其推廣提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用性成熟的SPF級健康未交配雌性SD大鼠80只，體重(200±20)g，購自浙江省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(浙)2014-0001；飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～22 ℃，相對濕度40%～50%，標準飼料和水飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗儀器與試劑 二步法免疫組化檢測系統(tǒng)，PV-900，北京中杉金橋生物技術有限公司；顯微鏡，上海譜騫光學儀器有限公司。90%乙醇，分析純，廣州市光華化學試劑廠；PCNA單克隆抗體，通用型二步法免疫組化檢測試劑盒，TUNEL試劑盒購于南京建成生物工程研究所；VEGF多抗試劑盒，NF-κB一抗均購于武漢博士德生物技術有限公司；DAB試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.1.3 實驗藥品 茜草購自北京同仁堂連鎖藥店有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖，茜草炭按照2015年版《中華人民共和國藥典》炒炭法(通則0213)相關規(guī)定炒制表面焦黑色；孕三烯酮，批準文號：國藥準字H19980020，規(guī)格：25 mg/粒，華潤紫竹藥業(yè)有限公司；注射用青霉素鈉，批準文號：國藥準字H13020657，規(guī)格：2.4 g(400萬U)，華北制藥股份有限公司；戊巴比妥鈉，批準文號：國藥準字H31021724，規(guī)格：0.25 g/瓶，上海新亞藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 取茜草炭800 g，加入8倍量90%乙醇加熱回流提取2次，每次90 min，殘渣加8倍量水加熱回流提取2次，每次90 min，合并4次濾液，減壓回收溶劑至干，干膏得率為20.08%。分別按照給藥劑量取適量干膏，以0.9%生理鹽水稀釋至相應濃度。

1.2.2 動物模型的建造 SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，每天同一時間進行陰道涂片(以0.9%生理鹽水沖洗陰道后，吸取少量陰道分泌物涂片鏡檢，鏡下見有大量表層脫落細胞者為動情期)，監(jiān)測并統(tǒng)計大鼠動情規(guī)律，待規(guī)律穩(wěn)定后于第3個動情期進行EMT模型建立。以自體子宮內(nèi)膜移植法[6]建立模型：取大鼠，以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠取仰臥位，四肢及頭部均固定于手術板上，下腹部剪毛備皮，碘伏消毒。于無菌條件下，沿腹中線尿道口上方1 cm處縱行剪開約3 cm的皮膚切口，逐層剪開腹壁肌肉及腹膜，進入腹腔，分離并暴露左側子宮角，以行端對端吻合術切下左側子宮角中段長約2 cm，置于盛有生理鹽水的無菌培養(yǎng)皿中。取與肌層分離的子宮內(nèi)膜，剪成0.5 cm×0.5 cm大小的內(nèi)膜塊。取內(nèi)膜塊，以可吸收縫線四角縫固于右側腹壁血管交叉處，內(nèi)膜面貼腹壁。以生理鹽水沖洗腹腔，逐層縫合腹部切口。術后肌注青霉素0.4萬U/只，連續(xù)5 d，預防感染。術后大鼠分籠單放，使其自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)。于術后4周再次開腹，觀察移植物生理形態(tài)。造模成功標準：出現(xiàn)移植灶體積增大，呈現(xiàn)內(nèi)有澄清液體積聚的囊狀，移植物被結締組織覆蓋，并有血管形成，質(zhì)地軟。假手術組僅進行開腹操作，不進行子宮內(nèi)膜移植。

1.2.3 動物分組及給藥 將建模成功的大鼠飼養(yǎng)1個月后，取60只隨機分為6組，分別為模型組、QCS低劑量組[900 mg/(kg·d)]、QCS中劑量組[1 800 mg/(kg·d)]、QCS高劑量組[3 600 mg/(kg·d)]、孕三烯酮組(每周給藥0.45 mg/kg，每周一、周四以0.9%生理鹽水溶解灌胃，其余時間以生理鹽水灌胃)及假手術組，模型組與假手術組每日分別以等量的0.9%生理鹽水灌胃[按照人體(70 kg)等效劑量換算：大鼠給藥劑量=6.3×人臨床劑量mg/kg，以此為低劑量組給藥量，茜草炭復合提取物給藥劑量均以茜草炭生藥量計，分別取對應量的復合提取物，以0.9%生理鹽水4 ml溶解灌胃]。連續(xù)給藥4周。

1.2.4 觀察異位病灶 末次灌胃后24 h，大鼠全部頸椎脫臼法處死，以游標卡尺測量給藥前后各組異位病灶的體積(V=0.52×長×寬×高，mm3)。于無菌條件下切取大鼠在位內(nèi)膜組織，以10%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.2.5 在位內(nèi)膜細胞增殖狀態(tài)的檢測 采用免疫組化法[7]檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)進行圖片采集，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析細胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)(%)=增殖細胞/(增殖細胞+正常細胞)×100%。

1.2.6 在位內(nèi)膜細胞凋亡狀態(tài)的檢測 采用TUNEL技術[8]，實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行，每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)進行圖片采集，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞/(凋亡細胞+正常細胞)×100%。

1.2.7 VEGF、NF-κB表達的檢測 以免疫組織化學法檢測VEGF、NF-κB蛋白的表達，以逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測VEGF mRNA及NF-κB mRNA的表達。實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行，應用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測定積分光密度(IOD)值，IOD值越大，表明蛋白及mRNA表達越強。每張切片隨機選取5個視野，取IOD均值。

2 結果

2.1 異位病灶的結果觀察 EMT主要病理性增殖癥狀的外在表現(xiàn)為異位內(nèi)膜病灶體積的變化，觀察病灶部位呈圓形或扁圓形的囊狀，囊內(nèi)充滿白色或淡黃色透明積液，其表面有血管生長。經(jīng)孕三烯酮及QCS治療后，病灶體積對比治療前均有減小，且孕三烯酮組及QCS的中、高劑量組與治療前比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，QCS低劑量組治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QCS高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與孕三烯酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組治療前后比較，病灶體積不但無縮小，反而繼續(xù)生長，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明病變?nèi)栽诎l(fā)展。見表1。

表1 各組試驗前后異位病灶體積比較(mm3)

注：與試驗前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與孕三烯酮組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠在位內(nèi)膜細胞增殖指數(shù)比較 經(jīng)PCNA法檢測六組大鼠的在位內(nèi)膜細胞增殖情況可知，模型組與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；孕三烯酮組及QCS中、高劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；QCS低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QCS高劑量組與孕三烯酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖1。

2.3 各組大鼠在位內(nèi)膜細胞凋亡指數(shù)比較 TUNEL陽性表現(xiàn)：凋亡細胞的細胞核為棕色或棕黃色，呈碎點狀分布，大小不一致。而正常細胞的細胞核經(jīng)HE染色為紫色，形態(tài)大小相對一致。每張切片均選取5個高倍鏡視野并進行數(shù)據(jù)分析。模型組與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；孕三烯酮組及QCS中、高劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；QCS低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QCS高劑量組與孕三烯酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

圖1 各組在位內(nèi)膜細胞增殖情況比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與孕三烯酮組比較，△P<0.05；1.假手術組，2.模型組，3.孕三烯酮組，4.QCS低劑量組，5.QCS中劑量組，6.QCS高劑量組(下同)

圖2 各組在位內(nèi)膜細胞凋亡情況比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與孕三烯酮組比較，△P<0.05

2.4 茜草炭復合提取物對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠內(nèi)膜組織VEGF及NF-κB的影響

2.4.1 VEGF蛋白及mRNA在EMT模型大鼠內(nèi)膜組織中的表達 應用免疫組織化學法及RT-PCR法檢測各組VEGF蛋白及mRNA的表達，結果以IOD均值表示。模型組與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；孕三烯酮組及QCS中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；QCS低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QCS高劑量組與孕三烯酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4.2 NF-κB蛋白及mRNA在EMT模型大鼠內(nèi)膜組織中的表達 應用免疫組織化學法及RT-PCR法檢測各組NF-κB蛋白及mRNA的表達，結果以IOD均值表示。模型組與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；孕三烯酮組及QCS中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；QCS低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QCS高劑量組與孕三烯酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 各組VEGF蛋白及mRNA的表達情況比較

注：與模型組比較，#P<0.05；與孕三烯酮組比較，△P<0.05

表3 各組NF-κB蛋白及mRNA的表達情況比較

注：與模型組比較，#P<0.05；與孕三烯酮組比較，△P<0.05

3 討論

EMT是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體腔以外的部位，為育齡期女性常見病、多發(fā)病[9]。雖然EMT是公認的良性疾病，但因其具有轉移、種植、生長等惡性腫瘤相關的生物學特性，仍具有一定的惡變率，亦是婦產(chǎn)科的棘手疾病之一。因其具有多因素、多環(huán)節(jié)致病的復雜性發(fā)病機制，給研究者帶來較多困難，目前針對EMT的具體發(fā)病機制仍不明確。

因EMT具體致病機制的多樣性及不確定性，針對本病的治療方法亦多種多樣[10-12]。臨床上主要采用西藥、手術及中醫(yī)藥治療。因其為激素依賴性疾病，故西藥主要為激素類藥物，此類藥物價格昂貴且不良反應較大，給患者帶來經(jīng)濟及生活雙重壓力，患者依從性較差，臨床適用性差，難以普遍推廣；大多數(shù)患者首選手術治療，手術治療伴隨著復發(fā)率高，即接二連三的手術亦給患者帶來較大困擾。針對此種情況，中醫(yī)藥療法逐漸突出其治療疾病多靶點、多途徑的優(yōu)勢，既能改善患者的臨床癥狀，減輕疾病帶給患者的痛苦，又能克服西藥不良反應大及手術復發(fā)率高的缺點。探索出比較適用的中醫(yī)藥療法，為治療本病提供一個新的思路和方向。目前尋找中藥復方從細胞增殖、凋亡及內(nèi)膜組織血管中的多種因子進行EMT病因病機的探討成為目前治療EMT的研究熱點。

研究表明，VEGF為促進血管生成的重要因子之一，新血管的形成可促進內(nèi)膜的生長、轉移及擴散,而內(nèi)膜的生長又可上調(diào)VEGF的表達，最終導致病灶的蔓延[13-15]。NF-κB為細胞非特異性的轉錄因子，可調(diào)節(jié)多種細胞、生長因子及部分活性蛋白基因的轉錄，廣泛參與機體的免疫、炎癥等生理病理過程，研究表明，NF-κB因子的異常活化，可引起局部的炎癥反應，促進病灶擴大[16-17]。

本研究以中醫(yī)針對EMT的“血瘀”病機理論為指導，以自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，采用臨床抗血瘀效果顯著[18-19]的茜草炭復合提取物(QCS)探究作用機理。結果表明，治療后，孕三烯酮組及QCS中、高劑量組病灶體積均小于模型組，且QCS高劑量組病灶體積小于孕三烯酮組；孕三烯酮及QCS中、高劑量均能顯著促進在位內(nèi)膜細胞凋亡，抑制增殖，且QCS高劑量效果優(yōu)于孕三烯酮；孕三烯酮及QCS中、高劑量均能顯著下調(diào)在位內(nèi)膜VEGF、NF-κB蛋白及mRNA的表達，且QCS高劑量下調(diào)效果優(yōu)于孕三烯酮。

綜上所述，茜草炭復合提取物治療子宮內(nèi)膜異位癥的主要機制為促進在位內(nèi)膜細胞凋亡，抑制在位內(nèi)膜細胞增殖，且能顯著下調(diào)在位內(nèi)膜VEGF、NF-κB蛋白及mRNA的表達，QCS中、高劑量療效良好，不良反應較少。

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