正電子類阿爾茨海默病顯像劑18F-AV45的自動化合成及影響因素

萬 強，劉 楠

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川瀘州 646000）

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原因未明、以漸進性記憶減退、認知障礙及人格改變?yōu)橹饕R床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，主要發(fā)生于老年人，其病理特征主要為患者全腦萎縮，大腦皮質和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞外出現(xiàn)β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積形成老年斑（senile plaques，SP）以及大腦皮質和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞內異常磷酸化tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）。隨著人類預期壽命的延長，AD的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。我國是AD患者人數(shù)最多的國家，隨著我國人口老齡化趨勢的進一步加快，AD患者已成為我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的重大負擔和公共衛(wèi)生難題，AD的早期診斷有利于盡早通過藥物干預的形式延緩該病進程[1]。（E）-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-fluoroethoxy)ethoxy)ethoxy)pyridin-3-yl)vinyl)-N-m ethyl benzenamine，18F-AV45）是一種由放射性核素氟-18（18F）標記的苯乙烯基吡啶衍生物，是美國食品與藥品管理局(FDA)批準的首個用于AD診斷的正電子類藥物，通過與Aβ特異性結合進而達到診斷目的，實現(xiàn)無創(chuàng)方式在體內實現(xiàn)對Aβ沉積變化的觀察，臨床上已廣泛應用于Aβ相關疾病研究[2-11]。目前，國內外對18F-AV45的合成研究報道較少[12-14]，本文在參考相關文獻的基礎上，使用國產氟多功能合成模塊實現(xiàn)對18F-AV45的合成與標記，并考察不同因素對于合成效率的影響以獲得高質量、高產率的18F-AV45來滿足科研與臨床的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

德國SIEMENS公司Eclipse HP/RD醫(yī)用回旋加速器；派特(北京)科技有限公司PET-MF-2V-IT-I氟多功能合成模塊：配有放射性檢測器、半制備HPLC、UV IS200紫外分光光度計(Alltech公司)；美國CAPINTEC公司CRC-15R放射性活度儀；天津蘭博公司Lab Alliance高效液相色譜儀。無水乙腈；4，7，13，16，21，24-六氧雜-1，10-二氮雜雙 環(huán)［8，8，8］二十六碳烷（Kryptfix2．2．2，K222）；無水二甲亞砜；(E)-2-(2-(2-(5-(4-(叔丁氧基羰基)苯乙烯基)吡啶-2-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯（AV105）：西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科自行合成；Sep-Pak QMA、Sep-Pak C18小柱，美國 Waters公司產品；對照品19F-AV45：江蘇原子能研究所；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.118F-AV45的合成方法

在18F-多功能自動化合成模塊上完成18F-AV45的合成。即以AV105為前體，與18F-發(fā)生親核反應后，再經(jīng)酸水解，堿中和后，產品經(jīng)過HPLC純化后獲得18F-AV45（合成路線見圖1）。

圖1 18F-AV45合成路線圖

1.2.218F-多功能自動化合成模塊合成步驟

1.2.2.118F-多功能自動化合成模塊的主要組成

主要包括18F-的捕獲、18F-的標記水解和產品的純化和分離等部分。由管路系統(tǒng)、負壓泵系統(tǒng)、氣液傳輸系統(tǒng)、風加熱冷卻系統(tǒng)、HPLC系統(tǒng)（流動相，進樣環(huán)，HPLC泵，C18制備柱，紫外探測器，放射性γ射線探測器）及計算機控制系統(tǒng)等組成（見圖2）。

圖2 18F-AV45自動化合成系統(tǒng)示意圖

1.2.2.218F-AV45合成前準備

18F-多功能自動化合成模塊分別用水、乙腈進行雙管清洗。HPLC系統(tǒng)平衡基線。在終產品導出管路上安裝0.22 μm無菌濾膜和無菌針頭，針頭插入無菌真空接收瓶中，接收瓶另接一只帶有濾膜的無菌排氣針頭。

1.2.2.318F-的制備

由Eclipse HP/RD回旋加速器通過18O（p，n）18F反應生產，生產的18F-經(jīng)傳輸管線傳入六通球閥2號口。

1.2.2.4 ［18F］化物的分離

在六通球閥3號口連接活化后的陰離子捕獲柱（QMA）。在He氣作用下先將加速器生產的18F-傳至QMA柱捕獲，18O-H2O被收集于回收瓶中。使用1號瓶內 1 mL溶液（K2.2.2/K2CO313 mg/1.1 mg，CH3CN∶H2O=4∶1)淋洗QMA柱，將［18F］氟化物洗脫入反應管RV1中。

1.2.2.5 親核取代反應前系統(tǒng)除水

打開V8、V9，加熱反應瓶中混合溶液至105℃3 min，減壓蒸發(fā)干燥至反應管RV1內無明顯液體。加入2號瓶內2 mL乙腈溶液繼續(xù)減壓蒸發(fā)干燥，得到干燥的［K／K2.2.2］+18F-復合物。

1.2.2.6 親核取代反應

3號瓶中的前體（溶于1 mL無水DMSO/乙腈=1∶1）溶液在N2的作用下進入反應管RV1中，130℃加熱反應10 min完成標記。

1.2.2.7 水解反應

將4號瓶中的HCl（3 mol／L，1 mL）溶液壓入反應管RV1中，130℃加熱反應10 min，進行水解。

1.2.2.8 酸堿中和反應

（8）將5號瓶中NaOH（3 mol／L，1 mL）和6號瓶中5 mL 4%醋酸銨分別加入反應管RV1，中和混勻，轉移至反應管RV2；

1.2.2.9 固相柱純化

（9）將反應管RV2中液體轉移過V15、V17間的Sep-Pak C18柱，棄去廢液，用V11瓶中10 mL生理鹽水沖洗Sep-Pak C18柱，用V12瓶中2 mL乙腈溶液將Sep-Pak C18柱上粗產品洗入裝有3 mL 0.1 mol/L醋酸銨溶液的G0瓶中。

1.2.2.10 半制備柱分離

（10）將G0瓶中的產品用semi HPLC進行純化，流動相為乙腈/水（體積比為 55∶45），流速6 mL/min，收集產品至裝有20 ml注射用水的收集瓶中，并混勻。

1.2.2.11 終產品純化

（11）打開V19，將收集瓶中產品轉移過V22、V23間已活化的Sep-Pak C18柱，用10 mL注射用水沖洗Sep-Pak C18柱上殘留的乙腈溶液，用G4瓶中2 ml乙醇溶液將產品沖入裝有20 mL注射用水（含抗換血酸鈉）的產品瓶即得。

1.2.318F-AV45純度分析

采用Waters分析性HPLC分析其化學純度和放射化學純度，HPLC內配515泵，2487紫外檢測器，VisionHT C18 HL 5 μ柱（250 mm × 4.6 mm），流動相為45%的乙腈水溶液，流速為1 mL/min，檢測波長254 nm。

18F-AV45 的 tR=12.3 min，未 見 游 離18F-，radio-HPLC檢測放化純大于98%（見圖3）。

圖3 18F-AV45紫外吸收圖譜和放射性檢測圖譜

1.3 反應條件篩選

為了獲得更高的合成效率，我們對反應前體量、反應溫度、反應時間和前體溶劑進行了篩選，摸索出這些因素間最佳匹配關系，以獲得更高質量的18F-AV45。

2 結 果

2.1 前體量對合成效率的影響

選擇不同化學量的AV-45前體，固定K2.2.2與K2CO3的質量比為13 mg/1.1 mg，親核反應及水解溫度為130℃，55%乙腈水溶液為流動相，觀察AV-45前體用量對合成效率的影響（見表1）。

表1 前體量對18F-AV45合成效率的影響

從實驗結果可以看出，隨前體量增加，產率也在不斷升高，但當前體量超過8 mg時，收率變化不明顯，從合成效率上考慮，前體用量為4 mg時，即可獲得較為理想的合成效率。

2.2 溶劑對合成效率的影響

固定AV-45前體用量為4 mg，前體溶劑為二甲亞楓（DMSO）、50%二甲亞楓/乙腈（DMSO/CH3CN）溶液和乙腈（CH3CN）。CH3CN為溶劑合成效率較低，另外兩種不同溶劑下合成效率無明顯區(qū)別，分別為25.6%±3.3%(n=3)和26.4%±2.7%(n=3)。從溶劑性質方面考慮，由于DMSO黏度較大，溶劑轉移過程中容易出現(xiàn)黏附管線的情況，造成前體不必要的浪費，而加入一定量的乙腈可在不影響產率的基礎上保證前體的足量加入，因此確定溶劑為50%DMSO/CH3CN溶液（見表2）。

表2 前體溶劑對18F-AV45合成效率的影響

2.3 反應溫度對合成效率的影響

固定AV-45前體用量為4 mg，前體溶劑為50%DMSO/CH3CN溶液，55%CH3CN水溶液為流動相，觀察反應溫度對合成效率的影響（見表3）。

表3 反應溫度對18F-AV45合成效率的影響

標記反應溫度和18F-AV45合成效率之間有很大關系，過高或者過低的標記反應溫度都會明顯得影響18F-AV45的合成效率，130℃是我們選擇的最佳反應溫度。

2.4 反應時間對合成效率的影響

固定AV-45前體用量為4 mg，前體溶劑為50%DMSO/CH3CN溶液，反應溫度為130℃，55%乙腈水溶液為流動相，觀察反應時間對合成效率的影響。結果（見表4）。

表4 反應時間對18F-AV45合成效率的影響

在不影響正常標記反應過程的前提下，盡可能得縮短反應時間可以減少不必要的衰變損失，減少副反應的發(fā)生，從上表結果中可以看出，標記反應10 min最佳。

3 討 論

18F-AV45是一種能與β淀粉樣蛋白特異性結合并顯示其在腦內變化的新型正電子類顯像劑。本研究以AV105為前體，進行18F標記，獲得滿足臨床科研需求的18F-AV45，該標記方法簡單，標記率高，重復性好，radio-HPLC檢測放化純大于98%。

在18F標記過程中發(fā)現(xiàn)前體的用量與收率成正比，當前體的用量大于4 mg后產率趨于穩(wěn)定，因此前體量為4 mg。研究發(fā)現(xiàn)，反應溫度對反應有較大的影響，溫度過高或者過低會導致反應收率降低，最終選用130℃作為親核反應溫度。反應溶劑選擇了乙腈和二甲亞砜兩種極性非質子溶劑，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和溶劑性質選用50%二甲亞砜/乙腈溶液作為反應溶劑。反應時間的選擇主要考慮反應盡量完全和衰變損失之間的平衡，選擇了10 min作為最佳反應時間。由于該放射性藥物易被氧化，在最終產品中加入了少量抗壞血酸鈉用于抗氧化。

4 結 論

我們在PET-MF-2V-IT-I氟多功能合成模塊上一步反應完成18F-AV45合成，整個合成過程簡單、快捷，合成出的18F-AV45質量和產量均滿足臨床科研需求，為國內AD早期診斷與科學研究提供一定基礎。

1. Abbott A.DEMENTIA A problem for our age[J].Nature，2011，475(7355):S2-S4.

2. Declercq LD，Vandenberghe R，Koen Van Laere，et al.Drug Development in Alzheimer’s Disease[J].The Contribution of PET and SPECT Frontiers in Pharmacology，2016，7:88.

3. 吳華.Alzheimer病分子影像的前沿:Aβ淀粉樣蛋白PET顯像；中國神經(jīng)科學學會第十屆全國學術會議；2013.

4. Johnson KA，Sperling RA，Gidicsin CM，et al.Florbetapir(F18-AV-45)PET to assess amyloid burden in Alzheimer's disease dementia，mild cognitive impairment，and normal aging[J].Alzheimers Dement，2013，9(5 Suppl):S72-S83.

5. Jagust WJ，Bandy D，Chen K，et al.The Alzheimer's disease neuroimaging initiative positron emission tomography core[J].Alzheimers Dement,2010，6(3):221-229.

6. Payoux P，Delrieu J，Gallini A，et al.Cognitive and functional patterns of nondemented subjects with equivocal visual amyloid PET findings[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2015，42(9):1 459-1 468.

7. Ottoy J，Verhaeghe J，Niemantsverdriet E，et al.Validation of the semi-quantitative static SUVR method for[18F]-AV45 PET by pharmacokinetic modeling with an arterial input function[J].J Nucl Med,2017,58(9):1 483-1 489.

8. Bailly M，Ribeiro M J，Vercouillie J，et al.18F-FDG and 18F-florbetapir PET in clinical practice:regional analysis in mild cognitive impairment and Alzheimer disease[J].Clin Nucl Med,2015，40(2):e111-e116.

9. Farrell ME，Kennedy KM，Rodrigue KM，et al.Association of Longitudinal Cognitive Decline With Amyloid Burden in Middle-aged and Older Adults:Evidence for a Dose-Response Relationship[J].JAMA Neurol,2017，74(7):830-838.

10.Lee TH，Huang KL，Chang TY，et al.Early-phase 18F-AV-45 PET imaging can detect crossed cerebellar diaschisis following carotid artery stenosis and cerebral hypoperfusion[J].Curr Neurovasc Res，2017，14(3):258-265.

11.Kuo HC，Hsiao IT，Hsieh CJ，et al.Dual-phase 18F-florbetapir positron emission tomography in patients with primary progressive aphasia，Alzheimer's disease，and healthy controls:A preliminary study[J].J Formos Med Assoc，2017，116（12）：964-972.

12. Hayashi K，Tachibana A，Tazawa S，et al.Preparation and stability of ethanol-free solution of[18F]florbetapir([18F]AV-45)for positron emission tomography amyloid imaging[J].J Labelled Comp Radiopharm，2013，56(5):295-300.

13. Zha Z，Choi SR，Ploessl K，et al.Multidentate(18)F-polypegylated styrylpyridines as imaging agents for Abeta plaques in cerebral amyloid angiopathy(CAA)[J].J Med Chem,2011，54(23):8 085-8 098.

14.Yao CH，Lin KJ，Weng CC，et al.GMP-compliant automated synthesis of[(18)F]AV-45(Florbetapir F18)for imaging beta-amyloid plaques in human brain[J].Appl Radiat Isot，2010，68(12):2 293-2 297.