玉米秸稈不同發(fā)酵時期理化性狀和細菌群落多樣性

王秀紅，李欣欣，史向遠，周 靜，王保平，杜慧平，籍增順

(山西省農(nóng)業(yè)科學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西 太原 030031)

我國年產(chǎn)玉米秸稈約2.5億t，用作秸稈還田和牲畜粗飼料的總量不足60%，其余均被焚燒，造成資源浪費和環(huán)境污染[1]。玉米秸稈是一種很好的可再生生物質(zhì)資源，將秸稈通過好氧堆肥處理用作食用菌栽培料、設(shè)施園藝栽培基質(zhì)以及有機肥具有很好的應用前景[2-4]。微生物是堆肥過程中發(fā)揮分解腐熟作用的關(guān)鍵因子，了解發(fā)酵過程中微生物的菌群變化不僅可以從菌群消長變化的角度為好氧發(fā)酵機制積累資料，而且能為改進玉米秸稈好氧發(fā)酵堆肥的工藝參數(shù)提供參考。通過傳統(tǒng)平板培養(yǎng)僅能獲得1%～15%的可培養(yǎng)微生物，無法反映堆體中微生物群落的真實情況[5]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(Metagenomics)已成為當前研究環(huán)境微生物種群動態(tài)的有力工具，高通量測序技術(shù)可以避開傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法的局限性，能較全面地對生境中的微生物總DNA進行分析，靈敏、快速地檢測環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，從而獲得復雜生境中微生物種群變化的準確信息[6-8]。利用宏基因組學技術(shù)可以深入挖掘堆肥生境中各種類型的降解菌，發(fā)現(xiàn)新菌種[9-10]。Martins等[11]首次利用高通量測序技術(shù)對堆肥生境的微生物總DNA進行研究，開啟了對堆肥生境中高效降解菌群及其基因資源的認識，通過對圣保羅熱帶公園堆肥樣品總DNA測序，獲得300萬條序列，并發(fā)現(xiàn)變形菌門的乳酸桿菌在該堆肥生境中占據(jù)優(yōu)勢；此外，通過功能基因預測的112個纖維素酶相關(guān)蛋白質(zhì)中，有32個具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；可見，宏基因組技術(shù)在堆肥生境中分析微生物群落結(jié)構(gòu)變化上具有明顯優(yōu)勢。De Gannes等[12]利用454焦磷酸測序分析了3種木質(zhì)纖維素堆肥不同階段的菌群，結(jié)果顯示，隨著堆肥進程的變化，微生物群落發(fā)生明顯更替，堆肥嗜溫期和腐熟期微生物群落存在差異，嗜溫期微生物在腐熟期并不是先前推測的處于休眠狀態(tài)，認為堆肥所處發(fā)酵階段對微生物群落的影響比堆肥底物的類型更大。沈其榮等[13]研究表明，堆肥的有機質(zhì)分解主要發(fā)生在建堆后的30 d之內(nèi)，因此，掌握這一時期堆料好氧發(fā)酵過程中的理化性狀及微生物的種類和豐度對于改進堆肥工藝、提高腐熟效果至關(guān)重要。堆肥過程中細菌是最主要的優(yōu)勢菌群[14]，能夠影響堆料的腐熟進程。但是，關(guān)于玉米秸稈好氧發(fā)酵不同翻堆時期的細菌群落演替情況在宏基因組水平上報道較少。

本研究通過高通量Illumina MiseqTM宏基因組16S rRNA測序，對玉米秸稈條垛式堆肥不同翻堆時期的細菌菌群進行分析，以期從不同物種分類角度掌握好氧發(fā)酵的微生物菌群演替規(guī)律，認識影響玉米秸稈好氧發(fā)酵的關(guān)鍵菌群，為篩選功能菌株、制備微生物復合菌劑以及加快發(fā)酵進程指明研究方向并提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗地點設(shè)在山西省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心榆次東陽試驗基地。玉米秸稈好氧發(fā)酵采用3.00 m×1.50 m×1.35 m 的條垛式堆肥方式進行。主要原料為玉米秸稈，主要輔料為干牛糞，2種物料分別來自東陽基地試驗田和周邊養(yǎng)殖戶。將收集到的玉米秸稈粉碎至3～5 cm，干牛糞碾碎，每個條垛堆均為玉米秸稈粉350 kg和牛糞100 kg的混合，配以少量的生石膏粉、過磷酸鈣、尿素和豆餅，將C/N調(diào)節(jié)至30左右，調(diào)節(jié)水分含量至65%～70%，物料均勻混合，共設(shè)3次重復。建堆后每7 d翻堆一次，共翻堆5次。建堆初期及5次翻堆均從堆體不同長度的縱切面即外層(1～10 cm)、中層(25～45 cm)和內(nèi)層(60～75 cm)多點采樣，均勻混合后分別標記為CS0、CS1、CS2、CS3、CS4和CS5(CS：Corn straw)共6個樣品，用冰盒帶回實驗室。部分樣品冷藏或自然風干用于理化指標測定；部分樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱，送上海生工生物工程股份有限公司進行16S rRNA宏基因組測序和生物信息學分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 理化數(shù)據(jù)測定 理化指標測定參考劉雯雯[15]的方法進行。采用RC-4HC型溫濕度記錄儀實時測定距堆體外側(cè)45 cm深度處溫度；干燥失重法測定含水量；新鮮堆肥樣品與去離子水按1∶10(m/V)混合，于水平搖床上振蕩24 h，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清經(jīng)單層濾紙過濾后收集，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾得濾液，分別用pH計測定pH值、分光光度計測E4/E6值、TOC儀測定水溶性有機碳w(C)(Water-soluble organic carbon)和水溶性氮w(N)(Water-soluble nitrogen)；風干樣用TOC儀測定總有機碳、元素分析儀測定全氮、馬弗爐高溫灼燒測定有機物含量。

1.2.2 樣品基因組DNA提取 參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒方法提取細菌基因組DNA，操作步驟參照試劑盒使用說明書。

1.2.3 Illumina MiseqTM宏基因組測序 PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V3～V4通用引物。341F引物：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；805R引物：5′-AGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。30 μL PCR反應體系：2×Taqmaster Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol/L)1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，加無菌水定容至30 μL。PCR反應條件：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5個循環(huán)；94 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，共20個循環(huán)；72 ℃ 5 min。第1輪PCR結(jié)束后，引入Illumina橋式PCR兼容引物再進行第2輪擴增，擴增體系同第1輪，反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃30 s，共5個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，并對PCR產(chǎn)物DNA進行純化回收(0.6倍的磁珠Agencourt AMPure XP處理)，利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，樣品等比例混合后上機測序。

1.3 序列分析

1.3.1 序列預處理 去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后進行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.3.2 操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU) 利用Usearch軟件將所有樣本按照序列間的距離進行聚類，根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的OTU。在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，進行各類的OTU分析，從而了解樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等信息。

1.3.3 OTU多樣性分析 利用mothur軟件計算堆肥樣品細菌Alpha多樣性指數(shù)。用chao1指數(shù)估計群落中含OTU數(shù)目；用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)估算樣品中微生物多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高，相反，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低；Coverage表示各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，樣本中序列沒有被測出的概率越低，實際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況。各指數(shù)相關(guān)計算公式如下。

chao1指數(shù)：

①

Shannon指數(shù)：

②

Simpson指數(shù)：

③

Coverage計算：

④

式中，Schao1為估計的OTU數(shù)目；Sobs為實際觀測到的OTU數(shù)目；n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目；n2為含有2條序列的OTU數(shù)目；ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；N為序列總數(shù)。

1.3.4 物種分類 利用基于Bergey′s taxonomy的RDP classifier分類方式對OTU進行物種分類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，以SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時期的理化性狀分析

玉米秸稈好氧發(fā)酵不同時期堆料的理化性狀如表1所示。建堆時(CS0)堆體平均溫度34.0 ℃左右，第1次翻堆時(CS1)達到69.4 ℃，第2，3，4，5次翻堆后堆體溫度仍均能夠上升至55.0 ℃以上，說明好氧發(fā)酵時期堆體環(huán)境適宜，微生物活動旺盛。隨著發(fā)酵的進行，堆料含水量呈下降趨勢，從70.66%下降至58.00%。堆料pH值呈先下降后上升的趨勢，由于前3次翻堆時堆體內(nèi)微生物的活動導致有機酸的積累，pH值下降，后2次翻堆時堆體內(nèi)氨化作用占優(yōu)勢，pH值又上升，在第5次翻堆時上升至8.13。E4/E6從建堆到第5次翻堆呈無規(guī)律變化，說明堆料在好氧發(fā)酵期間代表腐熟程度的胡敏酸含量尚不穩(wěn)定。w(C)/w(N)在建堆和前3次翻堆時較高，后2次大幅降低，說明隨著發(fā)酵的延長，堆體微生物可直接利用的水溶性碳源減少，水溶性氮相對增加。有機物含量則呈下降趨勢，到第5次翻堆時，與建堆時相比下降了25.32個百分點。C/N值亦呈下降趨勢，從建堆時的31.36下降至第5次翻堆時的22.86。以上結(jié)果表明，玉米秸稈條垛式好氧發(fā)酵正常，堆料的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程比較順利。

表1 不同好氧發(fā)酵時期堆料的理化性狀Tab.1 Physicochemical characteristics of windrow during the different aerobic fermentation periods

注：不同大寫字母表示處理間差異達極顯著水平(P﹤0.01)；不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(P﹤0.05)。

Note：Capital letters indicate very significant difference among different treatments；Lowercase letters indicate significant difference among different treatments.

2.2 細菌群落多樣性分析

經(jīng)PCR、高通量Illumina MiseqTM宏基因組16S rRNA測序、片段拼接和質(zhì)控過濾后，獲得秸稈發(fā)酵6個時期樣品的有效序列為43 534～59 177條(表2)。由圖1的細菌群落豐富度稀疏曲線可知，隨著測序數(shù)量的增加，新的細菌菌系不斷出現(xiàn)，Shannon指數(shù)均快速上升，當測序條帶數(shù)量>20 000時，Shannon指數(shù)稀疏曲線趨于飽和，說明本研究的有效序列深度可用于描述整個細菌的群落結(jié)構(gòu)。在97%的相似水平上對有效序列進行多樣性分析，6個樣品的文庫覆蓋率均達到99%，表明絕大部分的細菌種群都能被檢測出，可以代表樣本的真實情況。Chao1指數(shù)是用來估計群落中含OTU的總數(shù)目，由表2可知，用Chao1指數(shù)估計不同堆肥時期物種的OTU總數(shù)稍高。Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高，所以不同時期的細菌多樣性從高到低排序為CS5>CS3>CS1>CS2>CS0>CS4，CS5具有較高細菌群落多樣性。Simpson指數(shù)越大，群落多樣性越低，結(jié)合Simpson指數(shù)來看，CS5細菌群落多樣性最高，CS1、CS2和CS3三者差異不明顯。CS0和CS4均表現(xiàn)出較低的群落多樣性，其中，以CS4群落多樣性最低。

圖1 細菌群落豐富度稀疏曲線Fig.1 Rarefaction Curve of the bacterial community abundance

樣品編號Sample numbers序列數(shù)目Sequence numbersOTU數(shù)目OTU numbersChao1指數(shù)Chao1 indexShannon指數(shù)Shannon indexSimpson指數(shù)Simpson index覆蓋率/%CoverageCS059 1771 0581 338.564.560.0399CS143 5341 5241 913.605.080.0299CS252 4821 1401 450.434.900.0299CS352 8571 6282 044.345.330.0299CS457 5501 2501 692.424.510.0599CS557 0031 8642 312.545.440.0199

2.3 不同細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平的組成和相對豐度

在6個發(fā)酵時期，細菌隨著發(fā)酵時間的延長菌群門類逐漸增多，在發(fā)酵初期(CS0)，堆體內(nèi)的微生物菌群豐度大于1%的優(yōu)勢門類僅有3種，到最后一次翻堆時(CS5)達到12種。好氧發(fā)酵期間共檢測到細菌門類30種，優(yōu)勢門類主要為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，它們的豐度之和在6個時期分別為88.88%，88.49%，91.88%，78.59%，58.62%和55.82%。4種門類在不同好氧發(fā)酵時期的菌群豐度不同，厚壁菌門為3.77%～75.69%，變形菌門為9.82%～35.72%，擬桿菌門為0.29%～36.00%，放線菌門為3.21%～13.83%。由表3可知，除了以上4種門類外，綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度在CS4和CS5時期分別達到22.61%和16.30%。說明好氧發(fā)酵期間細菌菌群的種類和數(shù)量增多。

表3 細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的組成及相對豐度Tab.3 Bacteral community composition and relative abundance at phylum level %

2.4 不同堆肥時期細菌群落結(jié)構(gòu)在目水平的組成和相對豐度

整個發(fā)酵期間共檢測到78種細菌目類，6個不同時期共享的細菌目類有23種(將豐度均高于1%的菌目認為是共享菌目)。每個時期相對豐度排在前7位的優(yōu)勢目類不同(圖2)，CS0的優(yōu)勢目為芽孢桿菌目(Bacillales)22.84%、嗜熱厭氧桿菌目(Thermoanaerobacterales)20.32%、放線菌目(Actinomycetales)13.28%、根瘤菌目(Rhizobiales)8.15%、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)4.31%、梭菌目(Clostridiales)3.4%、黏球菌目(Myxococcales)1.61%；CS1的優(yōu)勢目為擬桿菌目(Bacteroidales)14.66%、芽孢桿菌目13.53%、假單胞菌目(Pseudomonadales)10.03%、梭菌目9.38%、根瘤菌目8.53%、黃色單胞菌目7.43%和鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)3.33%；CS2的優(yōu)勢目為梭菌目41.04%、芽孢桿菌目24.14%、放線菌目5.75%、嗜熱厭氧桿菌目4.9%、黃色單胞菌目2.37%、厭氧繩菌目(Anaerolineales)1.93%和鹽堿厭氧菌目(Natranaerobiales)1.76%；CS3的優(yōu)勢目為鞘脂桿菌目13.88%、黃色單胞菌目8.48%、擬桿菌目8.35%、噬纖維菌目(Cytophagales)8.31%、假單胞菌目6.23%、黃桿菌目(Flavobacteriales)5.23%和根瘤菌目3.52%；CS4的優(yōu)勢目為厭氧繩菌目21.43%、嗜熱厭氧桿菌目9.09%、黃色單胞菌目9.09%、梭菌目8.23%、芽孢桿菌目5.23%、假單胞菌目4.78%和熱脫硫桿菌目(Thermodesulfobacteriales)2.43%；CS5的優(yōu)勢目為厭氧繩菌目15.14%、鞘脂桿菌目7.38%、梭菌目5.98%、噬纖維菌目5.39%、熱脫硫桿菌目4.36%、黃色單胞菌目4.05%和著色菌目(Chromatiales)3.16%。綜上所述，6個階段的共享優(yōu)勢目類(至少出現(xiàn)在3個時期)主要為芽孢桿菌目、梭菌目、黃色單胞菌目，嗜熱厭氧桿菌目、根瘤菌目、假單胞菌目和厭氧繩菌目，但其豐度在各個時期不同，如芽孢桿菌目在發(fā)酵前期CS0、CS1和CS2中分別為22.84%，13.53%和24.14%，但在發(fā)酵后期CS3、CS4和CS5中僅有1.51%，5.23%和1.18%。

圖2 不同發(fā)酵時期細菌群落結(jié)構(gòu)在目水平上的組成和相對豐度Fig.2 Bacterial community composition and relative abundance at order level at different fermentation periods

2.5 不同堆肥時期細菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的組成和相對豐度

圖3 不同發(fā)酵時期細菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成和相對豐度Fig.3 Heatmap of bacteral community composition and relative abundance at genus level at different fermentation periods

本次發(fā)酵期，共檢測到細菌屬有644種，其中厚壁菌門83個屬、變形菌門137個屬、放線菌門47個屬、擬桿菌門43個屬，圖3為部分菌屬的熱圖。不同發(fā)酵時期共享的主要屬(同種屬至少在3個樣品中相對豐度不小于1%)為Povalibacter、梭狀芽孢桿菌屬(ClostridiumⅢ)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、嗜熱脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和Chryseolinea。它們的高豐度體現(xiàn)在不同時期，Povalibacter在整個發(fā)酵時期豐度均較高，芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和嗜熱脲芽孢桿菌在建堆初期CS0和前2次翻堆(CS1和CS2)時較高，到后3次翻堆時下降至1%以下。梭狀芽孢桿菌屬豐度在建堆初期低于1%，但在第2次翻堆時達到15.57%。假單胞菌屬和Chryseolinea在發(fā)酵前期豐度較低，后期豐度較高。結(jié)果顯示，好氧發(fā)酵不同時期影響不同種類細菌的菌群豐度。

在屬水平上對不同時期進行聚類分析，結(jié)果顯示，CS3和CS5距離最近，CS0和CS4距離最近，CS1分別與CS3和CS5二者以及CS0和CS4二者之間距離較近，CS2與它們的距離最遠，說明CS3和CS5細菌菌群相似，CS0和CS4的細菌菌群相似，CS2與其他時期的細菌菌群距離最遠、相似性最差(圖3)。

3 討論與結(jié)論

3.1 好氧發(fā)酵時期的理化性狀

好氧發(fā)酵過程中實時監(jiān)測堆料的理化性狀對于堆肥品質(zhì)的掌控非常關(guān)鍵。堆料的初始w(C)/w(N)、含水量和pH值決定著堆體發(fā)酵能否正常啟動，這3個因素為微生物提供了必需的營養(yǎng)和生長條件。本研究中，堆體溫度快速上升，在發(fā)酵期間堆體深度45 cm處溫度均能達到55.0 ℃以上，說明好氧發(fā)酵正常，微生物活動旺盛，適時翻堆通氣是保持較高溫度的原因。微生物活動和繁殖所要求的適宜C/N值一般為25∶1，由于受到堆料原始組成結(jié)構(gòu)的影響，全部碳素并沒有被微生物直接快速利用，所以C/N稍高，可溶性的碳素就越多，從而有利于堆體發(fā)酵的啟動，合適的C/N對好氧發(fā)酵的啟動至關(guān)重要。一般認為，堆肥材料中初始C/N在26∶1～35∶1較為適宜[16]。E4/E6值能反映胡敏酸分子的穩(wěn)定程度和腐殖化程度，E4/E6值越小，表示分子中芳香環(huán)的縮合度、芳構(gòu)化度和分子量均較大，且平均存留時間越長[17-18]。本研究中，到第5次翻堆時E4/E6仍較高，說明此時堆體仍處于礦化階段，腐殖化程度還較低。

3.2 影響發(fā)酵期間的細菌群落結(jié)構(gòu)的因素

本研究在好氧發(fā)酵期間共檢測到30種細菌門類、78種細菌目類和644種已命名的細菌屬類，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門4個主導菌門的總豐度在6個發(fā)酵時期均較高。Antunes等[19]研究表明，堆肥高溫期的細菌分類優(yōu)勢門類占總分類reads的85%。張麗麗[20]同樣用玉米秸稈自然堆肥，共鑒定到了24個細菌門類，4個主導門類共占到樣品總分類reads的93.5%。表明厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門在堆肥好氧發(fā)酵階段作用最強，同時說明堆料配比及堆肥工藝會影響堆體內(nèi)的細菌門類及其相應豐度。

細菌群落的結(jié)構(gòu)組成會受到堆體高溫和通氣性的共同影響。張麗麗[20]利用發(fā)酵罐控制堆肥溫度和氧濃度，可以明顯提高堆肥中放線菌門和厚壁菌門的含量，并通過玉米秸稈堆肥試驗，發(fā)現(xiàn)在20～50 cm深度放線菌門會快速生長。賈洋洋[10]在秸稈堆肥生境的研究也表明，微生物白色菌絲生長旺盛的區(qū)位有著更高的胞外纖維素酶活性，具有更高的纖維素降解率，說明放線菌偏愛氧濃度較高的堆體深度。放線菌門之前被認為是堆肥嗜熱階段占據(jù)主導地位的細菌門類[21]，從本研究看，放線菌門類豐度雖然為主導門類，但豐度并不太高，可能與堆體供氧不足有關(guān)，所以及時翻堆是保證堆體供氧充足的有效措施[22]。有研究表明，堆肥過程中厚壁菌門的高豐度主要是其耐熱性和兼性厭氧性[23-24]，綠彎菌門也是一種兼性厭氧生物[25]。本研究中，厚壁菌門和綠彎菌門在發(fā)酵期間出現(xiàn)較高的比例，推測是由于本次發(fā)酵堆料含水量偏高，堆體偏緊實，內(nèi)部缺氧，兼性厭氧菌發(fā)揮作用的結(jié)果。高溫對擬桿菌門和變形菌門的生長有抑制作用，相對較低的溫度下更適合這2種門類的生長[26]，本研究堆體內(nèi)部缺氧，溫度較低，可能是變形菌門和擬桿菌門所占比例較大的原因。

3.3 好氧發(fā)酵期間的細菌群落結(jié)構(gòu)及菌群演替

不同發(fā)酵時期堆料微生物群落組成不同。張麗麗[20]研究結(jié)果表明，在堆肥初期時，占優(yōu)勢的主要菌屬為擬桿菌門和變形菌門，包括Petrimonas、Proteiniphilum和假單胞菌屬等，但到堆肥后期這些菌屬被厚壁菌門的芽孢桿菌屬和放線菌門的喜熱裂孢菌屬等所取代。本研究中，變形菌門的Povalibacter在整個發(fā)酵期均有較高的豐度，厚壁菌門的芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、嗜熱脲芽孢桿菌屬以及高溫單孢菌屬均在發(fā)酵前期豐度較高，發(fā)酵后期豐度較低。而厚壁菌門的梭狀芽孢桿菌屬、變形菌門的假單胞菌屬和擬桿菌門的Chryseolinea在發(fā)酵后期出現(xiàn)較高豐度，說明細菌群落隨著發(fā)酵進程發(fā)生了明顯的群落演替現(xiàn)象，起作用的菌屬類別及其相對豐度也發(fā)生了變化。

3.4 好氧發(fā)酵期間與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的菌群

厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門被認為是在木質(zhì)纖維素堆肥中主導的細菌門類，其中，放線菌門和厚壁菌門是好氧堆肥中主要的木質(zhì)纖維素降解微生物群落[14，20]，這2種門類在本研究中豐度較高，說明它們在玉米秸稈降解中起到關(guān)鍵作用。已有報道，厚壁菌門的熱桿菌屬(Thermobacillus)、放線菌門喜熱裂孢菌屬(Thermobifida)、嗜熱多孢菌屬(Thermopolyspora)、高溫單孢菌屬(Thermomonospora)、變形菌門假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)和纖維弧菌屬(Cellvibrio)是與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的菌屬[10，20，27]。Guo等[28]研究表明，在以麥草為主料的堆肥過程主要的優(yōu)勢種屬包括芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、高溫單孢菌屬、嗜熱梨囊鞭菌屬(Thermasporomyces)、假單胞菌屬和纖維弧菌屬(Cellvibrio)等。芽孢桿菌屬具有耐熱性，是木質(zhì)纖維素堆肥中厚壁菌門的一個常被鑒定到的屬[29-31]。但是在本研究中，熱桿菌屬、喜熱裂孢菌屬、嗜熱多孢菌屬、高溫單孢菌屬和類芽孢桿菌屬均是在建堆初期豐度較高，分別為2.29%，1.46%，2.41%，3.67%和1.15%，其他發(fā)酵時期豐度均較低。纖維弧菌屬建堆初期未檢測到，但在第3次翻堆時豐度達到4.52%。綜合以上說明好氧發(fā)酵不同時期和不同配比的堆料，出現(xiàn)木質(zhì)纖維素降解菌屬的種類和豐度不同[29-33]。本研究以玉米秸稈為主料的好氧發(fā)酵過程中，在6個發(fā)酵時期檢測到的共享屬有Povalibacter、梭狀芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、嗜熱脲芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和Chryseolinea，其中，變形菌門黃色單胞菌目的Povalibacter、厚壁菌門芽孢桿菌目的梭狀芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬以及擬桿菌門噬纖維素菌目的Chryseolinea尚未見與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的報道。所以，從這些菌屬中有可能篩選出與加快玉米秸稈快速腐熟的新菌種，下一步結(jié)合以PCR為基礎(chǔ)的DGGE等分子生物學技術(shù)進行各種降解功能菌株的分離研究，通過菌劑添加用于好氧發(fā)酵堆肥，將有助于加快堆肥腐熟和改善堆肥品質(zhì)。

堆料初始C/N、含水量以及pH值決定著玉米秸稈好氧發(fā)酵能否正常啟動，而及時翻堆可以確保堆料混合均勻，保證氧氣供應充分，微生物活動正常，使堆體正常升溫至55.0 ℃以上。本研究結(jié)果表明，玉米秸稈好氧發(fā)酵不同時期所涉及的細菌菌門、菌目和菌屬的數(shù)目及其豐度不同，表現(xiàn)出明顯的細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和菌群演替現(xiàn)象。玉米秸稈不同發(fā)酵期間共享的優(yōu)勢門類為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，共享的主要優(yōu)勢目類為芽孢桿菌目、梭菌目、黃色單胞菌目、嗜熱厭氧桿菌目、根瘤菌目、假單胞菌目和厭氧繩菌目，共享的主要屬為Povalibacter、梭狀芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、嗜熱脲芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和Chryseolinea，它們是玉米秸稈好氧發(fā)酵的關(guān)鍵性細菌類別，為進一步篩選與玉米秸稈快速腐熟的新菌種指明了研究方向，并提供了參考依據(jù)。

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