稻瘟病抗性基因Pi63啟動子4個構(gòu)建體的表達及抗性分析

徐 鑫，郭旭夢，劉松青，王曉婉，梁華兵，馬克恩，韋明英

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室,生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

水稻是世界上約一半人的主食. 近幾十年來，盡管由于高產(chǎn)品種的研發(fā)和栽培技術(shù)的改進等使水稻產(chǎn)量翻倍，但仍不能滿足全球日益增加的對水稻的需要[1]. 稻瘟病是影響所有水稻產(chǎn)區(qū)的嚴重病害，不但會導(dǎo)致水稻產(chǎn)量降低10%～30%，并且降低稻米品質(zhì). 在常用控制疾病的方法中，宿主抗性的應(yīng)用是最經(jīng)濟和最環(huán)保的方法[2]. 水稻稻瘟病抗性通常分為真性抗性(也稱作完全抗性或者質(zhì)量抗性)和田間抗性(也稱作部分抗性或者數(shù)量抗性). 稻瘟病抗性基因Pi63來源于日本九州的陸稻品種“Kahei”，該基因有非常強的田間抗性[3]. 初步研究表明，Pi63的抗性與其表達量成正相關(guān)[4].

為研究Pi63的表達調(diào)控機制，前期研究中利用生物信息學(xué)分析了Pi63的啟動子區(qū)域和抗病相關(guān)順式作用元件的位置及分布，根據(jù)預(yù)測構(gòu)建了4個不同長度的啟動子區(qū)域[5]. 在此基礎(chǔ)上，將這些啟動子缺失體連接Pi63全長基因并轉(zhuǎn)化植物雙元表達載體pMDC99.

遺傳轉(zhuǎn)化是作物改良和新基因功能鑒定的常用方法， 但目的基因的表達水平和遺傳穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的拷貝數(shù)有很大的關(guān)系. 因此，篩選出單拷貝或拷貝數(shù)少的轉(zhuǎn)基因株系對開展進一步的研究和應(yīng)用顯得尤為重要. 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測采用 Southern 雜交法，但該方法費時費力，要用到放射性同位素等具有潛在危險的藥品[6]. 近年來高通量、快速、靈敏的定量 PCR (qPCR)方法成為科研人員青睞的檢測方法之一[7].

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得帶有不同長度的啟動子區(qū)域的Pi63全長基因的轉(zhuǎn)基因水稻，選擇蔗糖磷酸合成酶基因(SPS) 作為內(nèi)源參照基因進行拷貝數(shù)估算，通過qPCR法檢測轉(zhuǎn)基因植株中Pi63基因的拷貝數(shù). 進一步將單拷貝植株接種稻瘟病菌種007，比較接種前后Pi63基因的表達量變化，分析順式作用元件之間的相互作用以及對Pi63抗性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

植物雙元表達載體為pMDC99-P0、 pMDC99-P1、pMDC99-P2和pMDC99-P3；稻瘟病菌株為標準菌株007；轉(zhuǎn)基因受體水稻品種為日本晴.

1.2 試劑

rTaq酶、DNA分子量Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq和其他分子生物學(xué)試劑均購自大連寶生物公司.

1.3 方法

1.3.1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

按照文獻[8]的方法，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對4個表達載體進行日本晴水稻的遺傳轉(zhuǎn)化.

1.3.2 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定

水稻DNA提取采用CTAB法[9]. 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定引物見表1. PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存. PCR反應(yīng)體系為15 μL，上下游引物( 10 μmol / L ) 各0.1 μL，DNA模板( 30 ng / μL)2 μL.

表1 PCR引物序列

Tab. 1 Primers sequences of PCR

引物編號引物名稱引物序列(5'-3')1Pi63-5'u-pst p0CATTAGCGTAGCTACT-GAGCC2Pi63-5'u-pst p1GCCATTACTGTGGATTGT-GG3Pi63-5'u-pst p2CCTTGTTCAGCAC-TAGAGAGC4Pi63-5'u-pst p3GGTGGAGCTTGTAGCAT-ACG5P0P1VRCTCGAACACATGGTACAT-GG6P2P3VRGGAATTGACTTGGAAGTT-GG7SPS-qHG-FCCTCTTCTAGCATCGAGGT-CAC8SPS-qHG-RCTCCCCGACGATCAGATA-CATG9Pi63-Copy-FCTAGTCGCCTCAACCATGT-GA10Pi63-Copy-RAGGTCTGTGATTCT-TCGAGGC11RUBQ1-FGGAGCTGCTGCTGT-TCTAGG12RUBQ1-RTTCAGACACCATCAAAC-CAGA13Pi63-FTCAATGAAGTAAGGCTA-ACGCT14Pi63-RTACTGTCCCTGTCTTCCCA-CA

1.3.3 轉(zhuǎn)基因T1代植株拷貝數(shù)鑒定

將P0、P1、P2、P3轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株的陽性苗利用CTAB法提取DNA，每個樣品3個重復(fù). 利用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)[10]. 引物SPS-qHG-F和SPS-qHG-R為內(nèi)參引物，Pi63-Copy-F和Pi63-Copy-R為目的基因引物. 實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：采用兩步法，第一步，95 ℃預(yù)變性10 s；第二步，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，同時在退火過程中檢測熒光信號變化，共進行40個循環(huán). 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL: SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，PCR上下游引物( 10 μmol / L ) 各0.3 μL，DNA模板( 30 ng / μL)2 μL.

Pi63啟動子標準曲線的制作：帶有目的基因的質(zhì)粒DNA做5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104倍稀釋，以這些稀釋的DNA作為模版進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，得到各梯度的Ct值.SPS基因標準曲線的制作是以水稻基因組DNA做2×105、2×104、2×103、2×102、2×101的梯度稀釋，以稀釋后的DNA作為實時熒光定量PCR的模版. 以SPS基因和Pi63啟動子的擴增Ct值為縱坐標，以起始模版數(shù)(S0和C0)的常用對數(shù)為橫坐標，繪制SPS基因和Pi63啟動子的實時熒光定量PCR標準曲線圖.

1.3.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株目的基因的拷貝數(shù)計算

由1.3.3測得的樣品的Ct值，并由方程S0=10-(Ct-44.687)/3.8017計算出該樣品的SPS基因的起始模版數(shù)，并由方程C0=10-(Ct-31.445)/2.0357計算出該樣品的Pi63啟動子的起始模版數(shù).

1.3.5 轉(zhuǎn)基因T1代植株表達量檢測

水稻種子播種在30 cm×20 cm×5 cm的盆中,放在溫室培養(yǎng). 共7排，每排15～20株.稻瘟病007菌種孢子在水稻幼苗4葉期接種. 接種前取第3片葉片用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄檢測接種前Pi63基因表達量. 使用噴槍將20 mL孢子懸浮液(105個孢子/ mL)分別噴到每盆水稻上，放置于相對濕度95%～100%和溫度的28 ℃的黑暗接種箱中保持24 h. 接種后轉(zhuǎn)移到28 °C的溫室，7 d后取樣. 選取病斑嚴重的第3片葉片用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后檢測接種后表達量.RNA提取方法參照文獻[11] .引物RUBQ1-F和RUBQ1-R為內(nèi)參引物，Pi63-F和Pi63-R為目的基因引物. 實時熒光定量PCR反應(yīng)程序參見1.3.3.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因T1代植株的陽性鑒定

對不同長度的啟動子連接Pi63全長基因(分別命名為P0、P1、P2、P3)的T1代轉(zhuǎn)基因植株進行陽性鑒定. P0的PCR擴增目的條帶長度為1027 bp(圖1-a)，鑒定得到17棵陽性苗；P1的PCR擴增目的條帶長度為278 bp(圖1-b)，鑒定得到15棵陽性苗，P2的PCR擴增目的條帶長度為1131 bp(圖1-c)，鑒定得到18棵陽性苗；P3的PCR擴增目的條帶為915 bp(圖1-d)，鑒定得到17棵陽性苗.

a) P0；b) P1；c) P2；d) P3M為分子標記DL2000；數(shù)字為轉(zhuǎn)基因植株編號；N為陰性對照日本晴；K為陽性對照Kahei圖1 T1代轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定Fig.1 Identification of T1 transgenic plants

2.2 轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)鑒定

2.2.1 標準曲線制作

SPS基因和Pi63啟動子的實時熒光定量PCR標準曲線圖如圖2. a圖是SPS基因標準曲線圖，b圖是Pi63啟動子標準曲線圖. 從中得到相關(guān)性方程S0=10-(Ct-44.687)/3.8017；C0=10-(Ct-31.445)/2.0326.SPS基因標準曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9922，Pi63啟動子標準曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9978，相關(guān)性高.

圖2 SPS和Pi63啟動子標準曲線圖Fig.2 The standard curve of SPS and Pi63 promoter

2.2.2 T1代轉(zhuǎn)基因植株目的基因的拷貝數(shù)計算

由2.2.1得到的相關(guān)性方程計算出SPS基因的起始模板數(shù)和樣品的Pi63啟動子的起始模板數(shù). 由于水稻內(nèi)參基因SPS是純合二倍體，因此Pi63啟動子的起始模版數(shù)除以SPS基因的起始模版數(shù)，再乘以2就是目的基因在水稻中基因組中的拷貝數(shù). 其中P0有7個單拷貝，2個假陽性；P1有4個單拷貝，1個假陽性；P2有7個單拷貝，2個假陽性；P1有8個單拷貝，1個假陽性(表2).

表2 轉(zhuǎn)基因植株目的基因拷貝數(shù)的估算Tab.2 Estimation of copy number of target gene in each transgenic line

2.3 轉(zhuǎn)基因T1代植株接種稻瘟病菌株前后Pi63基因表達量變化

如圖3，接種007菌種7 d后P1的啟動能力最強，Pi63基因表達量比其他3個缺失體的都高，其次是P0，P2和P3的啟動能力最弱. 比較接種前后表達量的變化，可以看出P1在稻瘟病菌種誘導(dǎo)后表達量增加最多，其次是P0，而P2和P3在稻瘟病誘導(dǎo)前后表達量變化不明顯. 推測可能是抗病相關(guān)的順式作用元件處于P1與P2中間的區(qū)域，P0到P1的區(qū)域存在負調(diào)控元件.

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因植株接種007菌株前后Pi63 表達量比較Fig.3 Expression of Pi63 in T1 progeny before and after inoculation with fungus strain 007

3 討論

通常轉(zhuǎn)基因受體植物中整合拷貝數(shù)為 1～2 的外源基因有較高的表達水平，而整合拷貝數(shù)較高的外源基因則會因出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象導(dǎo)致表達水平較低[12]. 為排除定量PCR法鑒定拷貝數(shù)實驗過程中微小的變化對結(jié)果的可能影響，本研究中設(shè)置了多個重復(fù)來比較驗證，用外源基因的Ct值減去內(nèi)標準基因的Ct值，將樣品DNA 濃度均一化[3]，保證了結(jié)果的準確性. 本研究中轉(zhuǎn)基因材料為T1代轉(zhuǎn)基因植株，拷貝數(shù)鑒定結(jié)果不能準確區(qū)分純合單拷貝和雜合雙拷貝，因此我們均選用雜合單拷貝用于后續(xù)基因表達量的分析.

植物的抗病能力與順式作用元件的調(diào)控密切相關(guān). 如脫落酸的信號通路正負調(diào)控因子WRKY蛋白特異性結(jié)合含有TGAC序列的順式作用元件[14, 15]；作為WRKY家族成員的WRKY45在真菌以及細菌引起的植物病理反應(yīng)中也起著很重要的抗性作用[16].實驗結(jié)果表明P1與P2中間的區(qū)域存在抗病相關(guān)的正調(diào)控，P0到P1的區(qū)域存在負調(diào)控元件，而整體分布在啟動子前端的是GCCCORE和CATATGGMSAUR分布在啟動子末端的是CPBCSPOR，是否是這幾個順式作用元件存在的位置和順式作用元件的相互影響來共同調(diào)控啟動子的啟動抗病能力還需進一步驗證.LUO等研究表明如BIHD1OS順式作用元件是OsBIHD1的結(jié)合位點，OsBIHD1能激活BTH基因進而調(diào)控植物抗病反應(yīng)[17]， 是否Pi63的啟動子順式作用元件之間也有類似的相互作用還待進一步研究.

參 考 文 獻

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