煙草維管束發(fā)育相關(guān)基因Nvas啟動(dòng)子順式作用元件鑒定

譚艷平，葉 蓮，何福收，褚 巍，邵敏敏

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家民委生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

啟動(dòng)子是DNA上一段能起始基因轉(zhuǎn)錄的序列，分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織器官特異型啟動(dòng)子. 組成型啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)能使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株各部位穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)[1]，這種特性會(huì)造成植物體內(nèi)大量的營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi). 組織特異型啟動(dòng)子能使外源基因只在特定的組織中表達(dá)，克服組成型啟動(dòng)子的缺點(diǎn)[2]. 在應(yīng)用上越來(lái)越多地選擇利用合適的組織特異型啟動(dòng)子來(lái)降低外源轉(zhuǎn)入基因的沉默風(fēng)險(xiǎn)，更有效地得到穩(wěn)定且性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因作物[3]. 植物從地下根部到地上部分是由維管系統(tǒng)連接，維管系統(tǒng)在支撐植物向上生長(zhǎng)以及水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸上起到了關(guān)鍵作用，但是許多病蟲(chóng)害也能利用維管束系統(tǒng)在植物體內(nèi)傳播，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育. 研究維管束組織特異型啟動(dòng)子可以使靶基因在維管束系統(tǒng)中特異表達(dá)，從而調(diào)節(jié)維管束生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物維管束病蟲(chóng)害的防控能力[4-7]. Singer等發(fā)現(xiàn)臍橙蔗糖合成酶1(CsSUS1p)啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在維管束韌皮部表達(dá)，可應(yīng)用于防治維管束疾病[8]. 許蘭珍等發(fā)現(xiàn)豇豆富甘氨酸蛋白基因(GRP)啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的韌皮部組織特異性，可以應(yīng)用于柑橘抗黃龍病基因工程育種[9]. 前期研究克隆了一個(gè)煙草維管束發(fā)育相關(guān)基因Nvas啟動(dòng)子序列，經(jīng)預(yù)測(cè)ATG+1至-463bp區(qū)域以內(nèi)含有維管束特異啟動(dòng)子順式作用元件和核心啟動(dòng)子區(qū). 為了弄清該啟動(dòng)子的各個(gè)元件，將該基因啟動(dòng)子ATG+1～-463區(qū)域分為10個(gè)5′端缺失片段并構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體[10, 11]，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況，鑒定啟動(dòng)子的各個(gè)元件，并進(jìn)一步探究Nvas啟動(dòng)子不同區(qū)段的生物學(xué)功能.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

載體W38型煙草種子，大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌EHA105、載體PUD18-T、植物表達(dá)載體pCAMBIA1302均由中南民族大學(xué)國(guó)家民委生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、NcoⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，DNA聚合酶(Taq酶、exTaq酶)購(gòu)自TaKaRa公司，其他常用化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán).

Thermal Cycler PCR儀(BIO-RAD, T100型)，Shandon Crytome FSE冷凍切片機(jī)，Nikon SMZ1500體式顯微鏡.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

在Nvas啟動(dòng)子ATG翻譯起始位點(diǎn)上游+1 ～ -463區(qū)域內(nèi)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)10個(gè)5′缺失載體引物(表1,1-11)及pCAMBIA1302上GFP設(shè)計(jì)引物(表1)用于陽(yáng)性鑒定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(表1,12-17).

表1 PCR引物序列Tab.1 Oligos sequences of PCR

1.2.2 啟動(dòng)子5′缺失載體的構(gòu)建

以W38型煙草DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)以F1 ～ F10和R引物62 ℃擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)得到長(zhǎng)度不同的5′缺失片段，回收連接到pMD18-T載體上[12, 13],并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.提取篩選出來(lái)的單菌落質(zhì)粒，利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序. 提取測(cè)序成功的樣品質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和NcoⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切割的雙元載體pCAMBIA1302上，以各啟動(dòng)子5′缺失片段替換pCAMBIA1302載體的CaMV35S啟動(dòng)子與GFP報(bào)告基因融合，構(gòu)建植物雙元表達(dá)啟動(dòng)子5′缺失載體，構(gòu)建圖如圖1. 熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，選取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)載體.

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草

將構(gòu)建成功的5′端缺失載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，篩選出轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌. 取在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)1 ～ 2個(gè)月的W38型煙草無(wú)菌葉片，用玻璃試管壓成直徑1 cm的圓形葉盤(pán)，利用農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉盤(pán)[14].然后在潮霉素選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 ～ 6周，分化培養(yǎng)基分化出煙草小芽，最后移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)出煙草植株后移置于蛭石中栽培.

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性鑒定

CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片基因組DNA，pCAMBIA1302質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，W38型煙草基因組DNA作為陰性對(duì)照，通過(guò)PCR技術(shù)以gfpF和gfpR引物61 ℃擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)篩選陽(yáng)性植株.

圖1 Nvas啟動(dòng)子5′缺失載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Vector construction of 5′ deletion of Nvas′s promoter

1.2.5 GFP熒光觀察

取陽(yáng)性煙草植株幼嫩葉片的葉柄部分，冷凍切片橫切成25 μm的薄片置于載玻片上，在體視顯微鏡下10000 ms曝光觀察綠色熒光.

1.2.6GFP報(bào)告基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)GFP報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量[15]. 以L25ribosomalprotein為煙草內(nèi)參基因，以qrtF、qrtR(表1)引物95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)檢測(cè)GFP報(bào)告基因相對(duì)表達(dá)量.每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 Nvas啟動(dòng)子5′缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

利用表1中設(shè)計(jì)的引物在W38型煙草基因組DNA中擴(kuò)增得到5′端缺失片段，經(jīng)擴(kuò)增測(cè)序等一系列步驟后，成功連接到載體pCAMBIA1302并熱激轉(zhuǎn)化DH5α，提取篩選出來(lái)的單菌落質(zhì)粒，利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增選取陽(yáng)性菌落，結(jié)果見(jiàn)圖2. 陽(yáng)性菌測(cè)序結(jié)果表明10個(gè)啟動(dòng)子5′缺失載體均構(gòu)建成功. 根據(jù)片段位點(diǎn)，將載體命名為P-216,P-243,P-264,P-284,P-316,P-337,P-379,P-402,P-436,P-463.

圖2 Nvas啟動(dòng)子5′缺失表達(dá)載體質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果Fig.2 The result of PCR for expression vectors with 5′ deletion of Nvas′s promoter

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性鑒定

將p-216等10個(gè)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功侵染煙草葉盤(pán)后，在潮霉素選擇培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)后，最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草共80株(圖3).

a)葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)；b) 葉盤(pán)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；c) 葉盤(pán)選擇培養(yǎng)；d) 愈傷組織分化出苗；e) 轉(zhuǎn)基因煙草生根培養(yǎng)圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)W38型煙草葉盤(pán)遺傳轉(zhuǎn)化Fig.3 The transformation in W38 Nicotiana tobacum mediated by Agrobacterium tumefaciens

利用gfpF和gfpR引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，pCAMBIA1302質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)，W38型煙草基因組DNA作為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果如圖4. 結(jié)果說(shuō)明5′端缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化W38型煙草成功，共得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株36株.

M：DL2000；1-2：p-216；3-4：p-243；5-6：p-264；7-8：p-284；9-10：p-316；11-12：p-337；13-14：p-379；15-16：p-402；17-18：p-436；19-20：p-463；21-22：p35S；23：陽(yáng)性對(duì)照；24：陰性對(duì)照?qǐng)D4 轉(zhuǎn)基因煙草植株P(guān)CR鑒定Fig.4 The identification of the Nicotiana tobacum transgenic plants by PCR

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草GFP熒光觀察

5′端缺失載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草葉柄熒光結(jié)果如圖5. p-216 ～ p-463均可觀察到綠色熒光，且熒光集中在維管束部位，而CaMV35S在葉柄其他細(xì)胞中也能觀察到綠色熒光. 結(jié)果表明Nvas啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)外源基因在維管束組織特異表達(dá). -216區(qū)域以內(nèi)存在核心啟動(dòng)子元件和維管束特異組織表達(dá)元件.

a) p-216；b) p-243；c) p-264；d) p-284；e) p-316；f) p-337；g) p-379；h)p-402；i)p-436；j) p-463；k) p35S圖5 不同長(zhǎng)度Nvas啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因煙草葉柄GFP熒光觀察結(jié)果Fig.5 The GFP expression in Nicotiana tobacum transformed with different length of Nvas′s promoter fragments

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草GFP相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

以CaMV35S啟動(dòng)子p35SGFP的表達(dá)量為1，各5′端缺失表達(dá)載體的GFP相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖6.Nvas啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的啟動(dòng)子活性明顯高于CaMV35S，表明該啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子. ATG+1 ～ -216以內(nèi)存在核心啟動(dòng)子元件及維管束組織特異表達(dá)元件. p-379、p-402相對(duì)表達(dá)量顯著增高，說(shuō)明在-337 ～ -379區(qū)域內(nèi)存在能增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的元件，-402 ～ -436區(qū)域有拮抗作用的元件.

圖6 不同長(zhǎng)度Nvas啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因煙草GFP相對(duì)表達(dá)量結(jié)果Fig.6 The relative expression result of GFP in Nicotiana tobacum transformed with different length of Nvas′s promoter fragments

3 結(jié)語(yǔ)

越來(lái)越多的研究通過(guò)尋找合適的啟動(dòng)子來(lái)解決外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)問(wèn)題. 常用的組成型啟動(dòng)子如CaMV35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子等能使外源基因在植物體整個(gè)生命周期及所有器官均表達(dá). 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能使外源基因在特定誘導(dǎo)條件下表達(dá)，組織特異型啟動(dòng)子能使外源基因在植株特定部位表達(dá)，從而避免了組成型啟動(dòng)子長(zhǎng)期高效表達(dá)外源基因而造成的生長(zhǎng)發(fā)育負(fù)效應(yīng)問(wèn)題[2]. 應(yīng)用不同組織特異型啟動(dòng)子有針對(duì)性地驅(qū)動(dòng)不同的外源基因，實(shí)現(xiàn)多外源基因共轉(zhuǎn)化植株[2]，從而得到能健康生長(zhǎng)、性狀優(yōu)良的品種. 組織特異型啟動(dòng)子Nvas的順式元件以及表達(dá)部位和活性是本研究主要關(guān)注的問(wèn)題，Nvas啟動(dòng)子-216 ～ -463區(qū)域均能驅(qū)動(dòng)GFP基因在煙草維管束組織中特異表達(dá)，ATG+1 ～ -216區(qū)域有能啟動(dòng)基因表達(dá)的核心啟動(dòng)子元件以及維管束特異表達(dá)元件，-337 ～ -379區(qū)域有能顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的元件. 該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性明顯高于CaMV35S，在基因工程中能驅(qū)動(dòng)外源基因在維管束組織中特異高效表達(dá). 有望應(yīng)用于防治維管束病害，提高作物抗病性.

參 考 文 獻(xiàn)

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