苦苣菜內(nèi)生菌的篩選及其次級代謝產(chǎn)物分析

鄧振山，孔召玉，席建鑫，張寶成

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000；2.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南昌 330000； 3.遵義師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,貴州遵義 563000)

內(nèi)生菌(Endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，但不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物，包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌、內(nèi)生真菌[1]，在植物組織中普遍存在，具有豐富的物種多樣性。1993年，Stierle等[2]首次從短葉紅豆杉分離得到1株能合成抗癌物質(zhì)的內(nèi)生真菌，證明內(nèi)生菌具有合成與宿主植物相同或相似的活性成分的功能。從而掀起了內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物研究的高潮，自此不斷有從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)抗菌、抗腫瘤等活性物質(zhì)的報(bào)道，而且據(jù)統(tǒng)計(jì)，從植物內(nèi)生菌分離得到的活性物質(zhì)中，約51%是新化合物[3]，因此,具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用植物的內(nèi)生菌已成為篩選新活性物質(zhì)的重要資源。迄今為止，已從植物內(nèi)生真菌中分離得到的197個(gè)活性物質(zhì)中，有52個(gè)是新化合物(新骨架)，其中具有抑菌活性的化合物多達(dá)87個(gè)[4]。由此看出，植物內(nèi)生菌在活性物質(zhì)篩選方面已表現(xiàn)出巨大的潛力。

苦苣菜(SonchusoleraceusL.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬(Sonchus)1～2 a生的草本植物，屬傳統(tǒng)中藥，其味苦，性寒，具有清熱解毒、涼血止血、保肝、抗腫瘤、治療心血管等作用。主要有效成分包括黃酮類、萜類、甾體類、香豆素類和木脂素類等化合物[5]，主治腸炎、痢疾、黃疸、咽喉腫痛、吐血和尿血等癥。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道苦苣菜總黃酮對CCl4肝損傷有明顯的保護(hù)作用，且研究發(fā)現(xiàn)苦苣菜全草具有一定的抑菌作用[6]。但現(xiàn)有文獻(xiàn)多集中于苦苣菜天然活性成分的研究，關(guān)于苦苣菜內(nèi)生菌藥用活性成分的研究鮮見報(bào)道。

鑒于藥用植物內(nèi)生菌具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值，為探究宿主植物與其內(nèi)生菌的共生關(guān)系，尋找植物內(nèi)生菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的有效成分，因此，本試驗(yàn)以陜北野生苦苣菜為材料，從中分離篩選出具有抑菌活性的菌株，并對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究與分析，以期為生物防治及疾病治療等方面提供新的研究途徑和良好的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 苦苣菜于2014年10月和2016年6月采自陜西省延安市棗園鎮(zhèn),選取無病蟲害、植株外形完整及距地下15 cm以上的苦苣菜全草，清洗瀝干后避光4 ℃冰箱冷藏，3 d內(nèi)將樣品處理完畢。

1.1.2 供試指示菌 本研究的指示菌均來自延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，由微生物試驗(yàn)室保藏，供試指示菌菌株見表1。

表1 供試指示菌Table 1 Microbes as indicators for inhibitory test

1.1.3 供試培養(yǎng)基 固體分離培養(yǎng)基：(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；(2)高氏Ⅰ號培養(yǎng)基；(3)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；(4)水瓊脂培養(yǎng)基；(5)Ⅰ型改良培養(yǎng)基:改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏 0.25 g,蛋白胨 0.5 g,NaCl 0.25 g,瓊脂 2 g，pH 7.2； 改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:10 g 馬鈴薯浸汁 100 mL，葡萄糖1 g，瓊脂 2 g；(6)Ⅱ型改良培養(yǎng)基:改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏 0.5 g，蛋白胨 1 g， NaCl 0.5 g，瓊脂2 g， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的苦苣菜浸汁100 mL， pH 7.2；改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:馬鈴薯20 g,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的苦苣菜浸汁100 mL，葡萄糖 2 g,瓊脂2 g[7]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:(1)～(3)3種培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 方 法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離與純化 選取新鮮、健康苦苣菜根、莖、葉，經(jīng)流水沖洗干凈后用濾紙吸去表面水分，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗30～60 s后，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%次氯酸鈉浸泡3～6 min，無菌水沖洗7～10次[8-9]。表面消毒后的樣品無菌狀態(tài)下切成0.2 cm×0.2 cm的小段(片)，每平板放置4個(gè)組織塊，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)4～6 d后[10-11]。待培養(yǎng)基中有可見菌落時(shí)，挑取周圍菌落移入相應(yīng)培養(yǎng)基純化，并進(jìn)行菌落形態(tài)描述，純化好的菌株于4 ℃冰箱斜面保藏，備用。同時(shí)，將最后一次處理的材料移入固體培養(yǎng)基，使其與培養(yǎng)基表面接觸1～3 min，取出后于28 ℃培養(yǎng)，以檢測滅菌效果[12]。

1.2.2 內(nèi)生菌體外抑菌活性測定 采用平板對峙培養(yǎng)法測定上述分離得到的內(nèi)生菌菌株的抑菌活性，純化內(nèi)生菌菌株和11株供試病原指示菌分別接種于PDA平板上,待活化后,在新鮮PDA平板中央，移取1塊直徑0.4 cm的病原菌菌餅(使用無菌打孔器制得，下同)，邊緣等距離處移入4塊直徑為0.4 cm的供試內(nèi)生菌菌餅，以僅移入直徑為0.4 cm的病原菌菌餅為對照。置于28 ℃ 的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4～6 d后，觀察各菌株的生長及抑制作用，待病原菌不再擴(kuò)大時(shí)，用刻度尺(0.02 mm)測量試驗(yàn)組病原菌直徑 (d1)，抑菌圈直徑(d)及對照組病原菌直徑(d0),并按照以下公式計(jì)算抑制率[13]。

抑制率=(d0-d1)/d0×100%

1.2.3 菌株液體發(fā)酵及產(chǎn)物的提取 用接種環(huán)挑取活化后的拮抗菌菌株,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)，溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min，7 d后，用4層紗布過濾,分為菌體和發(fā)酵液2部分。過濾得到的菌體采用甲醇超聲浸提，過濾收集浸提液，抽濾后合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，濃縮后于4 ℃冰箱保存，備用[14]。

1.2.4 苦苣菜有效成分提取 稱取苦苣菜全草30 g，加石油醚60 mL回流1 h取出苦苣菜，待樣品中的石油醚揮發(fā)干凈后，采用連續(xù)回流提取法和超聲提取法提取有效成分，濾過殘?jiān)?，?jīng)微孔濾膜過濾濃縮，合并2種方法所得提取液，于4 ℃冰箱保存[15]。

1.2.5 薄層層析(TLC)分析 將上述分離得到的樣品進(jìn)行TLC分析，展開劑為甲醇-四氯化碳(1∶6，體積比)，顯色劑為硝酸鋁-亞硝酸鈉溶液[16]，并通過鹽酸-鎂粉反應(yīng)[17]，觀察紫外光下的顯色，做進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.6 高效液相色譜(HPLC)分析 分別取2 mL苦苣菜提取液和菌株發(fā)酵液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，再進(jìn)行HPLC分析。HPLC分析的檢測條件為:Shimadzu ODS C18 色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫28 ℃，流動相為甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%磷酸溶液=50∶50(體積比)，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，UV200Ⅱ紫外可變檢測器檢測，檢測波長360 nm[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦苣菜內(nèi)生菌的分離結(jié)果

從苦苣菜的根、莖、葉中共分離得到95株內(nèi)生菌，根、莖、葉分別為32、24、39株(圖1和表2)。其中從葉部分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量最多，占總菌株數(shù)的41.05%，根次之，莖中最少。且內(nèi)生真菌數(shù)為63株，占總菌株數(shù)的66.32%，顯然，內(nèi)生真菌為苦苣菜體內(nèi)的優(yōu)勢菌群。

圖1 拮抗菌株的篩選結(jié)果Fig.1 Screening result of antagonistic endophytes

表2 苦苣菜不同組織中內(nèi)生菌的數(shù)量Table 2 Numbers of entophytes from different tissues of Sonchus oleraceus

2.2 抑菌活性的測定結(jié)果

95株內(nèi)生菌對11種指示菌進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，有20株至少對1種或多種指示菌具有抑菌活性，其中分別對指示菌B-02、B-03、B-04、B-05、B-06、B-07、B-09、B-10和B-11具有抑菌活性的菌株數(shù)分別占到菌株總數(shù)的12.63%、7.37%、13.68%、15.79%、10.53%、12.63%、9.47%、8.42%和9.47%。除對小麥赤霉病菌和蘋果炭疽病菌沒有抑制作用外，對其他的9種指示菌均有抗性。

值得注意的是，有7株菌株(分別分離自根的4株為UG-004、UG-036、CG-033和CG-035，莖的1株為CJ-014，葉的2株為UY-085和CY-009)均具有較廣的抗菌譜和較高的抗性，占菌株總數(shù)的7.37%。這7株內(nèi)生菌的抗菌譜均在6～8種之間，涉及的指示菌有9種(占指示菌總數(shù)的81.81%)，且抑菌圈直徑大于20 mm的高抗菌株有2株，其中1株分離自根的菌株UG-042的抑菌圈直徑更高，達(dá)28.72 mm(表3)。在活性菌株中，對煙草赤星病菌有抑制作用的菌株最多，為15株，占菌株總數(shù)的15.79%。另外，菌株UG-036對煙草赤星病菌的抑菌率高達(dá)(77.47±1.45)%，菌株UY-085對B-02和B-10的抑菌率也均達(dá)到70%以上(表4)，菌株CG-035和UY-085分別與8種指示菌B-02、B-04、B-05、B-06、B-07、B-09、B-10和B-11進(jìn)行對峙培養(yǎng)時(shí)，均出現(xiàn)較明顯的抑菌帶(圖2和圖3)。

2.3 TLC分析結(jié)果

薄層層析(TLC)檢測結(jié)果表明，菌株CG-035在Rf為0.35處有與苦苣菜標(biāo)準(zhǔn)提取液顏色相同、遷移率相當(dāng)?shù)娘@色帶(斑)(圖4、表5)，且通過鹽酸-鎂粉試管反應(yīng)，紫外光下的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)紫紅色黃酮類特征性顏色反應(yīng)。進(jìn)一步確定CG-035菌株具有能夠發(fā)酵產(chǎn)生黃酮類成分的能力。

表3 20株內(nèi)生菌對指示菌抑菌活性的測定結(jié)果Table 3 Inhibitory activity of 20 entophytes against tested microbes

表4 7株內(nèi)生菌對病原真菌的抑菌率Table 4 Antifungal activity of 7 endophyte strains %

8種植物病原菌由上到下依次為 Sequence of 8 different species of plant pathogens;B-02番茄灰霉病菌 B-02 Botrytis cinerea Pers.exfr.；B-04玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum；B-05煙草赤星病菌 Alternaria alternata；B-06棉花枯萎病菌 Fusarium oxyporum f.sp.vasinfectun；B-07稻瘟菌 Magnaporthe oryzae；B-09黃瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum；B-10蘋果腐爛病菌 Valsa mali；B-11西瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f.sp.niveum；下同 The same below

圖3 菌株UY-085對8種病原真菌的抑制作用(試驗(yàn)組)Fig.3 Antagonistic activities of UY-085 to 8 different species of plant pathogens,growth of pathogenic were limited(test group)

2.4 HPLC分析結(jié)果

發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC 圖譜(圖5)顯示，苦苣菜提取液出峰順序依次為：組分A在保留時(shí)間Rt=9.698 min處有一主要吸收峰，組分B在保留時(shí)間Rt=17.348 min處有一主要吸收峰，菌株CG-035的發(fā)酵產(chǎn)物的出峰順序依次為:組分a在保留時(shí)間Rt=1.494 min出現(xiàn)新的吸收峰，組分b在保留時(shí)間Rt=9.918 min 處有一主要吸收峰，組分b與組分A的保留時(shí)間相近，初步確定該菌株能夠發(fā)酵產(chǎn)生與苦苣菜提取液成分相同的黃酮類物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，苦苣菜根、莖及葉組織中均存在豐富的內(nèi)生菌資源，其中對植物病原菌具有不同程度的抑菌活性的菌株僅占菌株總數(shù)的21.05%，這與植物內(nèi)生菌具有抑菌活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[19-20]。然而，從中篩選的拮抗菌株的抑菌活性低，抗菌譜相對較窄，表明其代謝產(chǎn)物具有較好的選擇抗性，這也為篩選具有選擇抗性化合物提供了潛在資源。加之，對于拮抗菌株篩選也不能僅限于這些在平板試驗(yàn)中對病原菌有抑制作用的菌，有些菌雖然沒有表現(xiàn)出拮抗作用,但通過誘導(dǎo)作用產(chǎn)生抗性或者與病原菌發(fā)生營養(yǎng)競爭從而具有抑菌活性。因此，在篩選優(yōu)勢內(nèi)生菌方面還有待于對傳統(tǒng)的篩選條件進(jìn)行改進(jìn)，采用新型的篩選方法和技術(shù)，從而充分挖掘優(yōu)勢植物內(nèi)生菌資源。

J.CG-035發(fā)酵液 CG-035 metabolites；K.苦苣菜提取液 Extractive of S.oleraceus；C.空白發(fā)酵液 CK

可以看出，拮抗內(nèi)生菌菌株CG-035不僅具有較廣譜抑菌活性，而且能夠產(chǎn)生黃酮類或與其類似活性成分，國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，例如Strobel 等[20]從內(nèi)生菌感染的1種早熟禾

圖5 苦苣菜提取液和菌株CG-035發(fā)酵液色譜圖比較Fig.5 HPLC comparison of CG-035 metabolites and extractive of Sonchus oleraceus L.

表5 內(nèi)生菌CG-035發(fā)酵液與苦苣菜提取液相對遷移率比較Table 5 Rf comparison of endophyte CG-035 metabolites and extractive of Sonchus oleraceus L.

(Poaampla)中分離到數(shù)個(gè)有毒性的黃酮類化合物，南京師范大學(xué)王梅霞等[21]從銀杏中分離得到1株產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生真菌EG4?？梢?，植物內(nèi)生菌在活性物質(zhì)分離和提取方面存在巨大的潛力，然而，由于試驗(yàn)過程中所用提取方法、展開劑、顯色劑及柱壓等條件的限制，菌株CG-035的次級代謝產(chǎn)物也并非僅限于黃酮類化合物，故仍需要利用其他生物化學(xué)手段進(jìn)行提取、純化和鑒定，從而充分挖掘該菌株次級代謝產(chǎn)物的多樣性，并為尋找新的、具有選擇性抗性的活性成分提供新的材料。本試驗(yàn)采用薄層層析、硅膠柱層析以及高效液相色譜等方法對產(chǎn)于苦苣菜植物化學(xué)成分相同或相似化合物的內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，但并未涉及該菌株其他活性成分以及其他拮抗菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的研究，因此，在產(chǎn)生特殊活性成分的內(nèi)生菌以及產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控機(jī)制和種屬多樣性等方面還有待于進(jìn)一步探索。

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