乳腺癌組織中EZH2、SOX4蛋白表達(dá)變化及其意義

韓福蘭,毛榮軍,謝樂,吳燕杏,曾敏,陳增偉

(廣東省佛山市中醫(yī)院,廣東佛山528000)

乳腺癌致死的主要原因是癌細(xì)胞脫落后隨淋巴或血液播散全身，形成轉(zhuǎn)移病灶、種植腫瘤或乳腺癌復(fù)發(fā)。因此測(cè)定乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物指標(biāo)，明確其轉(zhuǎn)移機(jī)制，是制定合理乳腺癌臨床抗腫瘤治療方案、改善乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)研究熱點(diǎn)[1，2]。果蠅zeste 基因增強(qiáng)子的人類同源物2(EZH2)基因編碼的EZH2蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制子多梳蛋白復(fù)合體2(PRC2)的組成部分[3]，其主要通過催化組蛋白甲基化作用，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化，促進(jìn)前列腺癌、膀胱癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[4]。另有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率盒蛋白4(SOX4)通過激活TGF-β途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而提高卵巢癌細(xì)胞侵襲力[5，6]。但乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)變化及其臨床意義尚不明確。本研究探討了乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)變化，并分析其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，探討乳腺癌中EZH2、SOX4作為腫瘤標(biāo)記物的可能性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年10月～2015年6月于我院行手術(shù)治療的乳腺癌患者97例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)確診為乳腺癌，原發(fā)且術(shù)前未行抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥75周歲，合并其他腫瘤，術(shù)前經(jīng)放、化療，合并其他嚴(yán)重疾病。納入患者均為女性，年齡21～68(52.1±8.3)歲。腫瘤直徑≤3 cm者31例，>3 cm者66例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期84例，Ⅲ～Ⅳ期13例；分化程度高分化28例，中低分化69例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。留取手術(shù)切除乳腺癌組織標(biāo)本為觀察組，癌旁正常組織標(biāo)本為對(duì)照組(均切取自距離腫瘤組織≥3 cm處，病理檢查證實(shí)為正常乳腺組織)。

1.2 EZH2、SOX4蛋白檢測(cè) 采用免疫組化SP法。 將保存的石蠟包埋標(biāo)本4 μm層厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，按免疫組化SP法試劑盒(購自北京百奧萊博科技有限公司)說明操作。兔抗人SOX4多克隆抗體、兔抗磷酸化抑癌蛋白EZH2多克隆抗體均購自北京百奧萊博科技有限公司。以PBS為陰性對(duì)照，已知陽性染色切片為陽性對(duì)照。封片后鏡下觀察。

取4個(gè)100倍光學(xué)鏡下視野，每個(gè)視野至少含有200個(gè)細(xì)胞。①染色強(qiáng)度：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃棕色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。②陽性染色細(xì)胞數(shù)量占比：<5%計(jì)0分，5～<25%計(jì)1分，25～<50%計(jì)2分，50～<75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。將兩項(xiàng)得分相乘，結(jié)果0～3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)。將患者術(shù)后出院視為觀察起點(diǎn)，隨訪截止于2016年11月，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank法比較累積生存率和總生存時(shí)間。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組EZH2、SOX4蛋白表達(dá)比較 觀察組、對(duì)照組EZH2蛋白表達(dá)陽性率分別為80.41%(78/97)、48.45%(47/97)，兩組相比，P<0.05;SOX4蛋白陽性表達(dá)率分別為82.47%(80/97)、57.73%(56/97)，兩組相比，P<0.05。

2.2 觀察組乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 乳腺癌組織中EZH2蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(guān)(P均>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P均<0.05)；乳腺癌組織中SOX4蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、分化程度均無關(guān)(P均>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

表1 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γs=0.251，P=0.013)。

2.4 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 觀察組患者隨訪13～71個(gè)月，中位隨訪時(shí)間44個(gè)月。EZH2蛋白表達(dá)陰性、陽性者累積生存率分別為89.47%(17/19)、65.38%(51/78)，生存時(shí)間分別為(67.14±2.62)、(54.30±2.30)個(gè)月，EZH2蛋白表達(dá)陰性、陽性者累積生存率和總生存時(shí)間相比，P均<0.05。SOX4蛋白表達(dá)陰性、陽性者累積生存率分別為94.41%(16/17)、65.00%(52/80)，生存時(shí)間分別為(68.75±2.15)、(54.35±2.27)個(gè)月，SOX4蛋白表達(dá)陰性、陽性者累積生存率和總生存時(shí)間相比，P均<0.05。

3 討論

EZH2是哺乳動(dòng)物體內(nèi)組蛋白H3K27甲基化必須的兩種催化酶之一[7]。EZH2為中心的復(fù)合物PRC2介導(dǎo)H3K27形成H3K27me3，沉默包括Wnt在內(nèi)的多個(gè)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞EMT，抑制細(xì)胞衰老[8]和細(xì)胞分化[9]。因此可以推測(cè)EZH2蛋白表達(dá)的增強(qiáng)往往意味著腫瘤惡性程度的提高。目前已有研究表明EZH2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括前列腺癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、胃癌[12]等。本研究結(jié)果表明，乳腺癌組織中EZH2陽性表達(dá)率顯著高于癌旁非腫瘤組織，與推測(cè)和前人研究結(jié)果相符。同時(shí)EZH2在組織分化程度較低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，也與EZH2抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的作用相符。

基因家族SOX調(diào)控胚胎的發(fā)育，決定細(xì)胞的命運(yùn)。任何SOX基因的缺失、過表達(dá)或者突變都有可能造成心臟瓣膜缺失、腭裂等先天發(fā)育異常類疾病[13]。SOX4隸屬于SOX家族C族，目前僅找到一種由其編碼的蛋白產(chǎn)物，即SOX4蛋白，胚胎發(fā)育相關(guān)的上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞中均已發(fā)現(xiàn)SOX4蛋白表達(dá)，且SOX4能夠促進(jìn)相關(guān)胚胎細(xì)胞的增殖[14]。研究表明，SOX4蛋白能夠調(diào)控TGF-β通路[15]、PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路[16]、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT，進(jìn)而一定程度上誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，增加腫瘤的細(xì)胞的侵襲力。因此SOX4基因的異常高表達(dá)與多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，目前已經(jīng)得到證實(shí)的有肺癌[18]、白血病[19]、前列腺癌[20]等。本研究發(fā)現(xiàn)，SOX4在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，與前人研究結(jié)果相類似，這表明SOX4在乳腺癌細(xì)胞中的作用與其在其他腫瘤細(xì)胞中的相同。而SOX4對(duì)于EMT的促進(jìn)作用則體現(xiàn)在SOX4在發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組中陽性表達(dá)率顯著提高。同樣的，SOX4蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌患者組累積生存率與總生存時(shí)間均顯著低于陰性組，也提示SOX4蛋白表達(dá)陽性意味著患者預(yù)后較差。而與推測(cè)不同的是，本研究未發(fā)現(xiàn)SOX4蛋白表達(dá)在組織分化程度不同的患者組中有差異，這可能是因?yàn)镾OX4調(diào)控的信號(hào)通路眾多，相互作用復(fù)雜，對(duì)腫瘤細(xì)胞分化的促進(jìn)與抑制作用并存，從而無法檢測(cè)出明顯的差異。

Pan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SOX4能夠通過調(diào)控EZH2蛋白表達(dá)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞EMT。本研究Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示EZH2與SOX4蛋白表達(dá)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，提示在乳腺癌組織中SOX4對(duì)EMT的調(diào)控可能同樣通過對(duì)EZH2蛋白表達(dá)的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)，兩者有一定程度上的協(xié)同作用。本研究結(jié)果還顯示，EZH2、SOX4蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌患者預(yù)后較差，提示檢測(cè)乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達(dá)有助于臨床醫(yī)師判斷患者預(yù)后，有一定臨床意義。

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