急性淋巴細(xì)胞白血病患兒血漿miR150、miR155、miR233水平變化及其意義

何旭，楊昆，胡銀山，徐孫秋，馬春蓉

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，四川南充637000；2南充市中心醫(yī)院)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是以淋巴母細(xì)胞增生失調(diào)以及分化異常引起大量非成熟白細(xì)胞形成為特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占急性白血病的70%以上，是兒童白血病的常見類型[1,2]。隨醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，急性淋巴細(xì)胞白血病治愈率超過80%，顯著提高了患兒的生命質(zhì)量[3]。長(zhǎng)期化療給患兒肝腎功能、血液及神經(jīng)系統(tǒng)等帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，患兒病死率較高[4]。從分子生物學(xué)角度探討急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制，可為疾病的診斷、治療提供重要參考價(jià)值。微小RNA(miRNA)是新型非編碼小分子RNA，通過互補(bǔ)配對(duì)的方式特異性結(jié)合靶基因序列而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化等病理生理過程，miRNA還具有抑癌或者促癌作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)病過程密切相關(guān)[5,6]。miR150、miR155、miR233屬于miRNA家族，已有研究[7]表明其參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。目前關(guān)于miR150、miR155、miR233在急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用相關(guān)報(bào)道較少。2015年3月～2018年3月，我們觀察了118例ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233的表達(dá)水平變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月～2018年3月我院血液科收治的118例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病診療建議》(第4次修訂草案)中關(guān)于ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡≤14歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①T細(xì)胞、B細(xì)胞雜合ALL患兒；②合并有中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患兒；③合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾病。根據(jù)疾病狀態(tài)將觀察組患兒分為初診者、緩解者、復(fù)發(fā)者。初診者32例，其中男18例，女14例；年齡4～13(9.2±0.9)歲；病理分型為T淋巴細(xì)胞白血病8例，B淋巴細(xì)胞白血病24例；危險(xiǎn)度分型為低危型16例，中危型10例，高危型6例。緩解者46例，其中男26例，女20例；年齡3～14(8.9±1.2)歲；病理分型為T淋巴細(xì)胞白血病16例，B淋巴細(xì)胞白血病30例；危險(xiǎn)度分型為低危型22例，中危型18例，高危型6例。復(fù)發(fā)者40例，其中男22例，女18例；年齡3～13(9.3±1.0)歲；病理分型為T淋巴細(xì)胞白血病18例，B淋巴細(xì)胞白血病22例；危險(xiǎn)度分型為低危型20例，中危型12例，高危型8例。三者性別、年齡比較具有可比性(P均>0.05)。

隨機(jī)選取30例健康體檢兒童為對(duì)照組，其中男17例，女13例；年齡5～14(9.8±1.1)歲。觀察組、對(duì)照組患兒性別、年齡、病理分型及危險(xiǎn)度分型比較，P均>0.05，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象家屬在知情同意書上簽字。

1.2 血漿miR150、miR155、miR233檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法檢測(cè)各組血漿miR150、miR155、miR233。抽取兩組兒童清晨空腹外周靜脈血5 mL，分離血漿，按照RNA提取試劑盒(海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供)上的說明提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司提供)上的說明進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。用Real-Time PCR分析儀(美國(guó)Life Technologies公司提供)行qRT-PCR，所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL，包括2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，All-in-One miRNA qPCR Primer 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s預(yù)變性，95 ℃ 3 s變性，80 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH，以2-△△Ct表示miR150、miR155、miR233的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

兩組兒童血漿miR150、miR155、miR233相對(duì)表達(dá)量見表1。與對(duì)照組比較，觀察組血漿miR150、miR233水平降低，miR155表達(dá)升高(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，初診者、復(fù)發(fā)者血漿miR150、miR233水平降低，miR155水平升高(P均<0.05)；與緩解者比較，初診者、復(fù)發(fā)者血漿miR150、miR233水平降低，miR155水平升高(P均<0.05)。緩解者血漿miR150、miR155、miR233水平與對(duì)照組比較，P均>0.05。

表1 兩組兒童血漿miR150、miR155、miR233相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，※P<0.05；與緩解者比較，*P<0.05 。

初診ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233相對(duì)表達(dá)量與ALL臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表2。不同性別、年齡及病理分型組患兒血漿miR150、miR155、miR233表達(dá)水平比較，P均>0.05；不同危險(xiǎn)度分型患兒血漿miR150、miR155、miR233表達(dá)水平比較，P均<0.05，危險(xiǎn)度分型越高，患兒血漿miR150、miR233表達(dá)水平越低，miR155表達(dá)水平越高。

表2 初診ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233相對(duì)表達(dá)量與ALL臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

ALL發(fā)病過程中癌基因激活以及抑癌基因失活是引起細(xì)胞發(fā)生癌變的病理學(xué)基礎(chǔ)。miRNA是由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，它在人類病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，通過對(duì)調(diào)節(jié)信號(hào)分子而參與信號(hào)激活、細(xì)胞的增殖、分化、死亡等[9,10]。已有研究[11,12]表明，miRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，現(xiàn)已成為臨床輔助疾病診斷、治療及評(píng)估預(yù)后的重要標(biāo)志物。

miR150是miRNA家族成員之一，通過對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控而導(dǎo)致下游基因異常表達(dá)，引起免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)紊亂，最終引起惡性腫瘤的發(fā)生[13]。研究[7]顯示，miR150在NK/T細(xì)胞淋巴瘤以及慢性粒細(xì)胞性白血病等惡性腫瘤中呈低水平表達(dá)，而在骨肉瘤、胃癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤中呈高水平表達(dá)?？梢姡煌愋蛺盒阅[瘤中miR150作用不同。miR155是已知的致癌因子，通過在造血系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等惡性疾病中呈高表達(dá)水平而發(fā)揮致癌作用[14]。Faraoni 等[15]對(duì)急性髓性血病患者研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿miR155表達(dá)明顯升高，可作用評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。miR233在造血系統(tǒng)分化過程中通過表達(dá)上調(diào)而發(fā)揮重要生理功能，其表達(dá)異常則可引發(fā)血液系統(tǒng)惡性疾病。Han等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR233表達(dá)異常與兒童ALL預(yù)后密切相關(guān)，在初診期以及復(fù)發(fā)期患兒miR233表達(dá)下調(diào)，而在緩解期患兒中表達(dá)水平升高。

目前多數(shù)研究主要通過采集患者腫瘤組織或者骨髓的方式檢測(cè)miRNA，創(chuàng)傷較大，本研究觀察了急性淋巴細(xì)胞白血病患兒血漿中3種miRNA表達(dá)變化并探討其臨床意義。本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒血漿miR150、miR233表達(dá)水平低于對(duì)照組，miRNA155表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示血漿miR150、miR155、miR233異常表達(dá)可能參與了ALL的發(fā)病過程。進(jìn)一步分析不同臨床病理參數(shù)的ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示初診、復(fù)發(fā)的患兒血漿中miR150、miR233表達(dá)下調(diào)，miR155表達(dá)上調(diào)，提示miR150和miR233可能發(fā)揮了抑癌基因的作用，而miR155發(fā)揮了促癌基因的作用。初診者與復(fù)發(fā)者、緩解者與對(duì)照組之間血漿miR150、miR155、miR233表達(dá)水平無差異。表明血漿miR150、miR155、miR233水平可反映ALL患兒不同的疾病狀態(tài)。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿miR150、miR155、miR233表達(dá)水平與初診患兒的性別、年齡、病理分型與無關(guān)，而與危險(xiǎn)度分型密切相關(guān)，病情危險(xiǎn)程度越大，miR150、miR233表達(dá)水平越低，miR155表達(dá)水平越高，提示miR150、miR155、miR233可作為臨床評(píng)估急性淋巴細(xì)胞白血病危險(xiǎn)程度和預(yù)后，從而為指導(dǎo)臨床制定個(gè)體化治療方案提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] Fang Q, Yuan T, Li Y, et al. Prognostic significance of copy number alterations detected by multi-link probe amplification of multiple genes in adult?acute lymphoblastic leukemia[J]. Oncol Lett, 2018,15(4):5359-5367.

[2] Kubota H,Saida S,Kouzuki K,et al.Pediatricacute lymphoblastic leukemia?presenting with bone and joint pain[J]. Rinsho Ketsueki, 2018,59(2):167-173.

[3] Bartel DP. MicroRNA: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

[4] 陳曉曦,吳劍蓉,萬超敏,等.32例兒童復(fù)發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病的臨床特點(diǎn)及隨訪分析[J].華西醫(yī)學(xué),2015,30(5):885-889.

[5] Rapado-Gonzalez O,Majem B,Muinelo-Romay L, et al. Human salivarymicroRNAs?in Cancer[J].J Cancer,2018,9(4):638-649.

[6] Chakraborty C, Sharma AR, Sharma G, et al. The novel strategies for next-generation cancer treatment: miRNA combined with chemotherapeutic agents for the treatment of cancer[J]. Oncotarget, 2018,9(11):10164-10174.

[7] 陳霞,何倩.血漿miRNAs在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)不同疾病狀態(tài)中的表達(dá)特點(diǎn)[J].實(shí)用癌癥雜志,2017,32(2):192-195.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組,《中華兒科雜志》編輯委員會(huì).兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第四次修訂)[J].中華兒科雜志,2014,52(9):641-644.

[9] Zeng J, Yi X, Liu H, et al. Polymorphisms in four?microRNAs?and risk of oral squamous cell?cancer: a meta-analysis[J]. Oncotarget, 2018,9(9):8695-8705.

[10] Nair VB, Manasa VG, Sinto MS, et al. Differential Expression of MicroRNAs in Uterine Cervical Cancer and Its Implications in Carcinogenesis; An Integrative Approach[J]. Int J Gynecol Cancer,2018,28(3):553-562.

[11] Wang T, Xu H, Qi M, et al. miRNA dysregulation and the risk of metastasis and invasion in papillary thyroid?cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Oncotarget, 2017,9(4):5473-5479.

[12] McDonald AC, Vira M, Shen J, et al.Circulating?microRNAs?in plasma as potential biomarkers for the early detection of prostate?cancer[J].Prostate, 2018,78(6):411-418.

[13] 姚樂.microRNA在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用癌癥雜志,2016,31(1):165-168.

[14] 徐麗華,楊乃超,顏青,等.microRNA-155在小兒急性髓性白血病中的差異表達(dá)及分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2014,21(5):571-575.

[15] Faraoni I,Laterza S,Ardiri D,et al.MiR-424 and miR-155 deregulated expression in cytogenetically normal acute myeloid leukaemia:correlation with NPMI and FLT3 mutation status[J]. J Hematol Oncol, 2012,5(4):26.

[16] Han BW,Feng DD,Li ZG,et al.A set of miRNAs that involve in the pathways of drug resistance and leukemic stem-cell differentiation is associated with the risk of relapse and glucocorticoid response in childhood ALL[J]. Hum Mol Genet, 2011,20(24):4903-4915.