高效液相色譜法測定茄蒂中α-茄堿的不確定度評定

郭 斌，劉艷芳，尚巖巖，張德欣

茄子在我國種植范圍非常廣泛，是我國居民日常生活中的一種常見蔬菜。茄子不僅營養(yǎng)豐富，味道鮮美，并且價格低廉，深受廣大消費者的喜愛[1]。茄子渾身是寶，不僅食用價值很高，還具有抗癌、抗衰老、降血脂血壓、消炎止痛、降熱止血等多種生理功效，具備一定的藥用價值[1-3]。研究表明，此類生理功效主要由茄子植物體內含有的糖苷生物堿貢獻。茄子非可食部在日常生活中往往作為廢棄物被棄之不用，而α-茄堿在茄子非可食部分中(尤其是茄蒂中)分布較為可觀。目前，針對茄子非可食部分中α-茄堿的系列研究并不多見[4]?，F(xiàn)行檢測方法中，高效液相色譜法效果較好[5]。能夠準確測定茄子非可食部分中的α-茄堿含量，是研究利用α-茄堿的前提條件。本研究根據(jù)JJF1059-2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評定指南》中規(guī)定的方法和程序，分析HPLC法測定茄子非可食部分(茄蒂)中α-茄堿的各不確定度分量來源，并定量計算，可有效提高測定茄子非可食部分中α-茄堿含量的準確程度[6-8]。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與藥品

茄子非可食部分樣品購買自阜陽市本地的大潤發(fā)和永輝超市，采用隨機采樣原則，收集茄蒂部分待前處理。

α-茄堿標準樣品：購自美國Sigma公司(純度99%)，使用甲醇作為溶劑稀釋，配制為濃度為100 μg/mL的標準樣品儲備溶液；甲醇(國藥化學試劑，色譜級)；乙腈(TEDIA，色譜級)。

1.2 儀器設備

高效液相色譜儀(日本日立公司，L-2000型)；紫外檢測器(日本日立公司，L-2420型)；高速粉碎機(北京西化儀)；超聲波清洗機(昆山固特)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮)；C18液相色譜柱(Grace)；pH計(上海雷磁)。

1.3 樣品前處理

將收集到的茄蒂樣品于烘箱中以60 ℃烘干，使用高速粉碎機粉碎并過50目篩(孔徑0. 28 mm)，裝入離心管并貯于干燥器內備用。取10.00 g制備好的茄蒂樣品，用300 mL 80%的甲醇溶液溶解，在40 ℃下以超聲波提取40 min，抽濾后以少量2% HCl溶解濾液，調節(jié)pH為2-3，過濾后用15 mL氯仿萃取2次，棄去有機相；水相用0.5%的NaOH調節(jié)pH至11，再以100 mL氯仿分3次萃取，合并收集到的萃取液，于旋轉蒸發(fā)儀上蒸干后用10 mL甲醇溶液溶解瓶壁殘留物，在40 ℃下超聲洗脫40 min備用[9-10]。

1.4 高效液相色譜條件

采用HPLC-UV法。色譜柱：Grace C18 150 mm×4.6 mm(i.d),粒徑5 μm；流動相：Tris-HCl緩沖液(pH=7.40)-乙腈(75+25,v/v)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL；色譜柱平衡時間：20 min。

1.5 數(shù)學模型

茄蒂中α-茄堿的含量計算公式為：

式中：X——茄蒂試樣中α-茄堿的含量，(mg/g)；m——由標準曲線得出的進樣20 μLα-茄堿的質量，(mg)；V——樣品液最終洗脫體積，(mL)；M——茄蒂試樣的質量，(g)；

20——進樣體積，μL；P——加標回收率。

2 結果與分析

2.1 標準溶液的配制與測定

分別吸取0.5、1、2、4、8、16 mL α-茄堿標準樣品儲備溶液于100 mL容量瓶中，以甲醇定容。配制α-茄堿標準樣品工作溶液濃度分別為15、30、60、120、240、480 μg/mL，上機測定，每組設置重復樣三個，標準樣品工作溶液濃度測量結果見表1。

表1 α-茄堿標準品測量結果表

2.2 標準曲線方程

由表1中結果平均值擬合標準曲線方程：Y=131 401X+7 147.3,R2=0.999 9。α-茄堿標樣工作溶液濃度(μg/mL)為橫坐標X；峰高(H)為縱坐標Y。

2.3 α-茄堿含量測定結果不確定度來源的分析

以1.5中的數(shù)學模型作為分析基礎，可得，不確定度的來源主要有：(1)α-茄堿標準物質自身；(2)標準溶液的配制過程；(3)標準曲線；(4)待測樣品設置的重復樣；(5)加標回收率P。

2.4 各類來源不確定度的計算

2.4.1 來自α-茄堿標準物質自身的不確定度 在α-茄堿標準物質證書中，α-茄堿標樣純度為，純度偏差，根據(jù)JJF1059-2012，依據(jù)正態(tài)分布規(guī)律考慮，包含因子，則來自α-茄堿標品自身的相對不確定度為[6]：

2.4.2 α-茄堿標樣儲備溶液配制的不確定度α-茄堿標樣儲備溶液的濃度為3.000 mg/mL，具體配制方法為：稱量0.300 0 gα-茄堿標樣，以甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中。

稱量α-茄堿標樣時，需使用最大允許誤差為的電子天平。在置信區(qū)間為99%，包含因子k=3的情況下，依據(jù)正態(tài)分布規(guī)律考慮，則因稱量引入的標準不確定度為：

而α-茄堿標樣的稱量質量為0.300 0 g，則來自稱量α-茄堿標樣的相對不確定度：

表2 配制α-茄堿標樣工作溶液各種玻璃量具的不確定度

則配制α-茄堿標樣工作溶液的各種玻璃量具的不確定度：

2.4.4 來自標準曲線的不確定度 由2.2中的標準曲線方程可得，a=131 401,b=7 147.3。峰高Y測量的標準偏差SH為：

待測樣品測量次數(shù)為平行重復測量3次，則p=3，經(jīng)過計算得到待測樣品中α-茄堿的估計值含量為0.465 2 mg/g。

由擬合標準曲線時引入的標準不確定度為：

2.4.5 來自茄子非可食部(茄蒂)試樣的不確定度 茄蒂試樣的取樣質量為10.00 g。查閱稱量用電子天平的鑒定證書，可知其最大允差為±0.5 mg，重復性誤差為±0.1 mg，因此，按照均勻分布原則，來自茄子非可食部(茄蒂)試樣的相對不確定度為：

2.4.6 提取茄蒂試樣中的α-茄堿過程中引入的不確定度 提取茄蒂試樣中的α-茄堿時需加入10 mL甲醇溶解，而移液使用的10 mL A級刻度吸管最大允差為，按照均勻分布原則，提取茄蒂試樣中的α-茄堿過程中引入的相對不確定度為：

2.4.7 來自重復樣的不確定度 設置待測茄蒂試樣重復測量次數(shù)為6次，試樣中α-茄堿含量分布情況見表3。

表3 待測茄蒂試樣中α-茄堿的含量分布(mg/g)

2.4.8 加標回收率的不確定度 設置加標回收率實驗的主要目的是為了評價前處理操作過程對實驗結果的影響。五次加標回收率實驗的結果分別為97.33%、94.60%、96.00%、98.20%和95.93%，加標回收率平均值為96.41%。則加標回收率P的標準偏差為：

因此，加標回收率的相對不確定度：

2.5 α-茄堿含量合成標準不確定度

綜合上述不確定度分量結果，合成標準不確定度可計算為：

=1.288×10-2

2.6 擴展不確定度的計算

根據(jù)JJF1059-2012，在置信區(qū)間為95%，包含因子k=2的情況下，擴展不確定度由合成標準不確定度與包含因子的相乘可得。因此，擴展不確定度為：

由表3可知茄蒂試樣中α-茄堿含量的最佳估計值為0.465 2 mg/g。因此，在置信區(qū)間為95%，包含因子k=2的情況下，茄蒂試樣中α-茄堿的含量可以表示為(0.465 2±0.012 0)mg/g。

3 結 論

針對茄子中非可食部分(茄蒂)中α-茄堿的檢測，由于待測樣品的前處理方法較為繁雜，需要多種溶劑采用不同的方法反復提取，測量結果容易受到提取率、玻璃量具等因素的影響。本文通過HPLC-UV法對茄蒂中α-茄堿含量的不確定度分析和評定，評定結果表明各不確定度分量按照影響準確度的嚴重程度排列順序為加標回收率引入、配制標準物質工作溶液引入、擬合標準曲線引入、標準物質引入、使用甲醇提取茄蒂試樣時引入、配制標準儲備溶液使用的容量瓶引入、重復性實驗引入、稱量試樣引入和稱量標準樣品引入。

綜上所述，在測定茄子非可食部分(茄蒂)中α-茄堿的過程中，可通過以下途徑提高實驗結果的準確性，減少各不確定度分量的來源：(1)優(yōu)化前處理工藝，提高加標回收率；(2)提高溶液配制的技術要求和精細程度；(3)增加測定標準曲線校正點的重復次數(shù)等。

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