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    PTEN在銀屑病和皮膚非黑色素腫瘤中的表達(dá)和意義

    2018-07-02 07:55:26李婭娣蔓小紅尤立平張曉艷
    實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:鱗狀銀屑病表皮

    李婭娣,蔓小紅,尤立平,張曉艷

    銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),在銀屑病皮損表皮中,磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)的表達(dá)明顯高于正常人及銀屑病非皮損區(qū)表皮[1],磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)的蛋白水平及Akt的激酶活性明顯升高[2],提示銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)可能存在著PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路異?;罨??;罨腁kt通過(guò)磷酸化其下游幾個(gè)重要的靶蛋白:促Bcl-XL/Bcl-2凋 亡 因 子(Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoter,Bad),Caspase-9,原癌蛋白核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB),叉頭蛋白O家族(forkhead box O subfamily,F(xiàn)oxO),哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin,mTOR),加速 KC增殖。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)因子,銀屑病皮損內(nèi)PI3K/Akt的異?;罨欠袷怯蒔TEN的功能或表達(dá)的下調(diào)所致?另一方面,PTEN作為僅次于p53的第二大抑癌基因,主要通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的方式發(fā)揮其抑癌作用。本研究收集銀屑病、慢性濕疹、良惡性皮膚腫瘤(脂溢性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌皮損)以及正常人皮膚,采用免疫組化技術(shù)測(cè)定PTEN分布情況和蛋白水平,初步探討PTEN與銀屑病KC增殖的關(guān)系, PTEN在炎性增生性疾病與皮膚惡性腫瘤中的作用機(jī)制,以期揭示銀屑病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為治療銀屑病提供新的思路和新的靶向。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    19例尋常性進(jìn)行期銀屑病患者來(lái)自2007—2010年中日友好醫(yī)院皮膚科門(mén)診及住院確診患者,男10例,女9例,年齡18~65歲,平均(33.83±9.48)歲,病程7 d~2年,平均4個(gè)月;19例患者銀屑病皮損面積和嚴(yán)重度評(píng)分(PASI)為2.4~26.1分,平均(8.997±5.098)分。所有入選患者均需符合以下條件:近2個(gè)月無(wú)系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素及維A酸類(lèi)藥物治療史,近2個(gè)月無(wú)中波紫外線(UVB)或補(bǔ)骨脂素長(zhǎng)波紫外線(PUVA)光照史,近2周無(wú)外用藥物史;無(wú)內(nèi)科疾病,血常規(guī)、尿糞常規(guī)、肝腎功能及其他生化指標(biāo)均在正常范圍。正常對(duì)照選擇與銀屑病患者性別、年齡相匹配的中日友好醫(yī)院整形外科患者正常皮瓣18例,均無(wú)免疫系統(tǒng)疾病及相關(guān)家族史。其中男9例,女9例。兩組在性別、年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),遵照赫爾辛基宣言執(zhí)行,患者簽署知情同意書(shū)。

    1.2 試劑

    PTEN (C-term) RabMAb 抗體(美國(guó)Epitomics公司);β-肌動(dòng)蛋白抗體 NO. ab3280(美國(guó)abcam公司);ChemMateTMDAKO EnVisionTM/HRP,Rabbit/Mouse(ENV)(美國(guó)Epitomics公司);DAB顯色試劑盒(丹麥Dako公司);抗體稀釋液(丹麥Dako公司)。

    1.3 方法

    銀屑病患者按常規(guī)皮膚手術(shù)活檢取典型皮損,對(duì)照組皮膚均來(lái)自整形外科手術(shù)切除的多余正常皮膚。置于10%的甲醛溶液,常規(guī)石蠟包埋。中日友好醫(yī)院皮膚科蘇木精-伊紅染色(HE)病理診斷慢性濕疹、脂溢性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌各20例的蠟塊,行免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片,采用免疫組化SP法,操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,所有切片染色均在同一質(zhì)控條件下進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為扁桃體組織,PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

    1.4 圖像處理

    免疫組化切片采用日本NIKON公司的ECLIPSE 80i專(zhuān)業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。在相同條件下對(duì)同一批染色切片進(jìn)行觀察、圖像采集,通過(guò)NIS-Elements3.0軟件對(duì)所采集的圖像中陽(yáng)性部位(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá))進(jìn)行光密度(A)值的測(cè)定,每張皮膚組織切片在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取表皮部位各3處,計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均A值,進(jìn)行定量分析。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析比較,所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05確定為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    PTEN染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒。PTEN定位于正常皮膚、銀屑病皮損、慢性濕疹、脂溢性角化癥、皮膚基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)。正常對(duì)照者表皮各層細(xì)胞核和胞質(zhì)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖1);銀屑病皮損表皮內(nèi)可見(jiàn)稀疏淡染的棕色顆粒(圖2);慢性濕疹表皮內(nèi)各層細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖3);脂溢性角化癥表皮內(nèi)各層細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖4);皮膚基底細(xì)胞癌表皮內(nèi)各層細(xì)胞及真皮內(nèi)腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖5);皮膚鱗狀細(xì)胞癌表皮內(nèi)各層細(xì)胞及真皮內(nèi)腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊胞核和胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)稀疏淡染的棕色顆粒,個(gè)別細(xì)胞甚至無(wú)染色(圖6)。

    分別測(cè)定各個(gè)疾病組PTEN表達(dá)的平均A值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損、皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN著色的A值分別為0.078±0.052、0.036±0.132,平均A值均低于正常皮膚(0.659±0.120),三者之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中皮膚鱗狀細(xì)胞癌平均A值比銀屑病皮損低。慢性濕疹、脂溢性角化和皮膚基底細(xì)胞癌中PTEN著色的A值分別為0.711±0.162、0.694±0.055、0.704±0.165,高于正常皮膚,四者之間差異相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 討論

    PTEN蛋白是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)兼具脂質(zhì)和蛋白質(zhì)磷酸酶雙重活性的新型抑癌基因。PTEN定位于染色體10q23,在腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖分化和代謝、血管增生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、核糖體生物合成、mRNA翻譯等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]。PTEN通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)休止增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用,在肺部、結(jié)腸、前列腺、乳腺、子宮內(nèi)膜及腦部等眾多腫瘤性疾病中PTEN可發(fā)生突變、缺失和表達(dá)下降[4]。然而,PTEN在銀屑病皮損中的表達(dá)和功能研究,與皮膚良、惡性腫瘤之間的關(guān)系報(bào)道甚少。

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫組化染色結(jié)果采用量化分析,較以往染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比方法更為精確。同一批次染色組織切片,相同曝光情況下采集200倍圖像,利用專(zhuān)業(yè)圖像分析系統(tǒng)對(duì)同一切片多部位進(jìn)行光密度測(cè)定,取其平均值作為每個(gè)切片的A值,再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析。較之以前以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比結(jié)果來(lái)比較免疫組化染色強(qiáng)弱更加精確和可重復(fù)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可信。

    圖1 正常對(duì)照表皮PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    圖2 銀屑病表皮PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    圖3 慢性濕疹表皮PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    圖5 基底細(xì)胞癌PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    圖4 脂溢性角化表皮PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    圖6 皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN免疫組化組織病理(SP法×200)

    筆者前期研究提示,銀屑病皮損中PI3K/Akt通道調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵性分子PI3K亞單位P110(PI3K-P110)特異性高表達(dá)[1],磷酸化Akt的蛋白水平與Akt的激酶活性明顯升高[2],推測(cè)銀屑病皮損中可能存在PI3K/Akt通路異?;罨TEN在銀屑病皮損中低表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明,PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游PTEN表達(dá)低下,使本來(lái)PTEN致PIP3去磷酸化成為PIP2,逆轉(zhuǎn)P13K的作用降低,繼而Akt活性增強(qiáng),引發(fā)PI3K/Akt通路過(guò)度活化。下游一系列靶蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng):FOXO3失活,進(jìn)而下調(diào)p27kip1和p130Rb2,上調(diào)cyclin D1表達(dá)[5],使細(xì)胞周期加速,促進(jìn)細(xì)胞增殖。mTOR磷酸化水平升高,實(shí)驗(yàn)證明銀屑病皮損內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化使角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖[6]。PTEN還可激活受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK),介導(dǎo)有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期。在銀屑病中,PTEN缺乏致MAPK信號(hào)通路過(guò)度活化,引發(fā)細(xì)胞過(guò)度增殖和對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性下降[7]。

    在良性炎癥性表皮增殖性疾病如慢性濕疹和脂溢性角化癥中,PTEN正常表達(dá)甚至略多于正常皮膚表達(dá),提示這兩種疾病表皮增殖機(jī)制與PTEN無(wú)關(guān)。已證實(shí)脂溢性角化癥中PIK3CA,AKT1存在善意突變,無(wú)PTEN突變,發(fā)病與PI3K/PTEN/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路無(wú)關(guān)[8]。低度惡性增殖性皮膚病變基底細(xì)胞癌中PTEN正常表達(dá),說(shuō)明與PTEN在眾多人類(lèi)腫瘤中缺失或突變導(dǎo)致其喪失抑癌作用不同。從蛋白水平看,PTEN似乎沒(méi)有在皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞增殖發(fā)展中起作用。研究發(fā)現(xiàn)皮膚基底細(xì)胞癌的分子發(fā)生機(jī)制是Hedgehog (Hh)傳導(dǎo)通路異常活化[9]。然而,PI3K/Akt可與Hh通路一起協(xié)同作用致腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育[10]。因此,研究PTEN在皮膚基底細(xì)胞癌中的功能機(jī)制將對(duì)皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展具有重要意義。本研究測(cè)定顯示,皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN低表達(dá),與既往研究結(jié)果一致。人和小鼠的眾多實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的抑癌作用。體外人KC、體內(nèi)皮膚腫瘤化學(xué)模型表明Cowden's患者皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損內(nèi)PTEN功能降低。小鼠敲除PTEN將會(huì)導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌[11]。Li等[12]研究顯示,皮膚鱗狀細(xì)胞癌中PI3K/PTEN/Akt通路活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲,抑制細(xì)胞凋亡。

    本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果示PTEN在銀屑病和皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中均低表達(dá),與多數(shù)腫瘤細(xì)胞中PTEN缺失有相似變化。但銀屑病并不能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生概率增加,或并不伴隨腫瘤發(fā)生和發(fā)展??赡艿脑蛞环矫婺[瘤發(fā)生是一個(gè)多重因素參與網(wǎng)絡(luò)化的復(fù)雜的調(diào)控的過(guò)程,單一因素PTEN缺失不能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[13];另一方面也許銀屑病中PTEN下調(diào)表達(dá)的數(shù)量不夠低,不足以引起腫瘤發(fā)生。Yoshimoto等[14]證實(shí)PTEN蛋白表達(dá)水平的高低與腫瘤患者的病理分級(jí)及預(yù)后有關(guān)?;颊邜盒远仍礁撸A(yù)后越差、PTEN蛋白水平越低。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)更低于銀屑病皮損中的表達(dá)量,推斷PTEN在組織中含量低到一定量時(shí)才會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

    綜上所述,PTEN可能在銀屑病KC增殖方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。PTEN在銀屑病中低表達(dá),負(fù)調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路的作用減弱致PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路異?;罨?,通過(guò)下游多個(gè)靶分子作用縮短細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng),使銀屑病不斷發(fā)生發(fā)展。但需要更進(jìn)一步的研究,如體外PTEN活性研究、PTEN基因轉(zhuǎn)染、PTEN敲除動(dòng)物模型等來(lái)揭示PTEN在銀屑病KC過(guò)度增殖和異常凋亡中的確切功能,和其在皮膚腫瘤間的關(guān)系,對(duì)了解銀屑病病因及尋找治療藥物有很大的幫助。

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