HPLC-MS/MS法測定依卡倍特鈉原料藥中潛在遺傳毒性雜質(zhì)

丁希穎，吉小龍，李 博，毛白楊，嚴(yán) 方*，狄 斌**

(1中國藥科大學(xué)江蘇省藥物分子設(shè)計與成藥性優(yōu)化重點實驗室，南京 210009；2中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009；3亞邦醫(yī)藥研究院合成部，常州 213161；4常州亞邦制藥有限公司,常州 213161)

藥物中含量很低的遺傳毒性雜質(zhì)，都可能會引起人體基因發(fā)生突變或染色體斷裂和重排，進(jìn)而引發(fā)腫瘤[1-2]。2006年起，歐洲藥品管理局(EMA)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(ICH)陸續(xù)對遺傳毒性雜質(zhì)的控制做出特別規(guī)定?？茖W(xué)家們一方面致力于準(zhǔn)確有效地評價[3-4](Ames Ⅱ試驗、彗星試驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測微核試驗等)或預(yù)測[5](QSAR等)化合物的遺傳毒性；另一方面，針對原料藥中痕量(根據(jù)ICH M7通用原則中毒理學(xué)關(guān)注閾值TTC計算)遺傳毒性雜質(zhì)，也建立了很多快速高效的分析方法(LC-MS、GC-MS、LC-MS/MS、HPLC衍生化等[6-9])。尤其在化合物安全性數(shù)據(jù)不足的情況下，任何含有警示結(jié)構(gòu)[2]的化合物均應(yīng)該引起人們的重視，區(qū)別于一般的雜質(zhì)來進(jìn)行監(jiān)管。

依卡倍特鈉(ecabet sodium)作為一種傳統(tǒng)的抗?jié)兯幬?，可以抗菌、消炎和抑制胃酸分泌。其抗?jié)兊闹饕饔脵C(jī)制是形成一層保護(hù)膜覆蓋在炎癥受損處[10]。此外依卡倍特鈉還能治療胃部幽門螺桿菌感染[11]；也常被用來與其他藥物聯(lián)合使用治療胃潰瘍[12]。

依卡倍特鈉由依卡倍特經(jīng)過成鹽反應(yīng)得到。而依卡倍特具有苯磺酸的結(jié)構(gòu)，其在成鹽工藝中使用乙醇作為溶劑，因此很有可能會產(chǎn)生包含遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)(苯基磺酸酯[2])的雜質(zhì)(雜質(zhì)Ⅰ)，其分子式為C22H32O5S，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該雜質(zhì)屬于ICH M7指導(dǎo)原則中第3類雜質(zhì)(無遺傳毒性數(shù)據(jù)、含有與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)的警示結(jié)構(gòu))。考慮到依卡倍特鈉最大服用劑量較大(每日2 g)，如果按照TTC的計算方法(根據(jù)ICH M7通用原則中的相關(guān)規(guī)定)，該類遺傳毒雜質(zhì)的含量(×10-4%)不得超過0.75，因此，急需開發(fā)一種靈敏度高且專屬性強(qiáng)的定量分析方法。

文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，對于依卡倍特鈉有關(guān)物質(zhì)的考察大多停留在總雜質(zhì)和非特異性雜質(zhì)、降解雜質(zhì)上，未見文獻(xiàn)關(guān)注過遺傳毒性雜質(zhì)[13-14]。本文提到的潛在遺傳毒性雜質(zhì)為有機(jī)酯類，極性弱，在日本藥典方法和現(xiàn)有文獻(xiàn)方法條件下很難被洗脫；此外，現(xiàn)有的HPLC方法靈敏度也不適用于遺傳毒性雜質(zhì)的分析。在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上[15]，本研究通過改變流動相比例和pH以及檢測手段建立HPLC-MS/MS分離法，用于依卡倍特鈉原料藥中的遺傳毒性雜質(zhì)的檢測。

Figure1 Chemical structure of potential genotoxic impurity in ecabet sodium (Imp-I)

1 材 料

1.1 試 劑

依卡倍特鈉樣品(批號：CPC-055-1702001、CPC-055-1702002、CPC-055-1702003、ZJT-161-1702001、ZJT-161-1702002、ZJT-161-1702003，常州亞邦制藥有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Tedia有限公司)；超純水(由美國Millipore-Q超純水儀自制)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

UltiMate3000型液相色譜儀(美國戴安公司)；配備電噴霧離子源的Thermo Finnigan TSQ三重四極桿質(zhì)譜，Thermo Syncronis C18色譜柱(4.6 mm×150 cm，5 μm)(美國賽默飛世爾科技公司)；Agilent 6200型飛行時間質(zhì)譜(美國安捷倫科技有限公司)；Bruker AV500 MHz 傅里葉變換-核磁共振儀(美國布魯克科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 雜質(zhì)Ⅰ的合成

將依卡倍特(50.00 g,131.58 mmol)和甲苯(300 mL)分別加入500 mL三頸瓶中，室溫條件下攪拌。向反應(yīng)液中緩慢地滴加二氯亞砜(100 mL)，滴畢，將反應(yīng)液加熱至回流狀態(tài),在回流過程中，固體完全消失,形成紅色澄清溶液。保持回流狀態(tài)3～4 h，反應(yīng)結(jié)束后減壓濃縮得大量的黃色固體。將黃色固體加入四氫呋喃水溶液(400 mL,1∶6)中，室溫下攪拌17 h至反應(yīng)結(jié)束。減壓除去反應(yīng)液中的THF，形成含有水的黃色黏稠狀物，用甲基叔丁基醚(3×100 mL)萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮后得黃色固體(50.00 g,95.29%)。取黃色固體粗品20.00 g溶解在乙醇750 mL中，冰水浴下冷卻至4 ℃。保持該溫度，滴加氫氧化鈉水溶液(2.75 mmol,50 mL)，繼續(xù)攪拌30 min。然后滴加10%稀鹽酸，直到pH 2～3不再滴加，滴加過程中內(nèi)溫不超過5 ℃。過濾，取部分濾餅柱色譜純化得到產(chǎn)品(100 mg,99.9%)。MS：m/z407.2[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,500 MHz):2.30(1H,d,J=12.10 Hz,-CH2),1.51(2H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),1.63(1H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),2.07(1H,d,J=12.15 Hz,-CH),2.91(1H,m,-CH2),3.03(1H,dd,J=6.15～6.30 Hz,-CH2),1.51(2H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),7.74(1H,s,Ar-H),7.35(1H,s,Ar-H),3.67(1H,t,J=6.55 Hz,-CH),1.23(15H,m,H-16,17,18,19,22,5-CH3),4.06(2H,d,J=6.75 Hz,-CH2)。雜質(zhì)Ⅰ合成路徑見圖2。

Figure2 Synthetic route of Imp-I

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

采用Thermo Syncronis C18色譜柱(15 cm×4.6 mm,5 μm)，流動相A相為5 mmol/L乙酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至3.0)，B相為純乙腈，采用梯度洗脫：0 min 50%B，4 min 50%B,12 min 80%B,16 min 80%B,16.1 min 50%B,20 min 50%B，流速1 mL/min。進(jìn)樣量為20 μL，柱溫40 ℃。

采用電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子掃描模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式下選擇離子對m/z407→379進(jìn)行測定。毛細(xì)管溫度350 ℃，霧化氮氣壓力300 kPa，輔助氣壓力35 kPa，噴霧電壓3.5 kV，CID氬氣0.2 Pa，碰撞解離能量：45 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 對照品溶液 精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對照品約15 mg，置100 mL量瓶中，加稀釋劑純甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1.5 μg/mL對照品儲備液；精密量取5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為75 ng/mL的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取依卡倍特鈉供試品約1 g，置10 mL量瓶中，用甲醇振搖并超聲使溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的依卡倍特鈉供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性 分別取稀釋劑純甲醇按，75 ng/mL的雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液和100 mg/mL的依卡倍特鈉供試品溶液按上述條件進(jìn)行分析，并記錄峰面積。圖3結(jié)果顯示，雜質(zhì)Ⅰ的保留時間為12.33 min，而主成分依卡倍特鈉和稀釋劑甲醇對其檢測均沒有干擾。

Figure3 Characteristic LC-MS/MS chromatograms of (A) blank,(B) Imp-I and (C) ecabet sodium

2.4.2 線性試驗和定量限(LOQ) 取1.5 μg/mL對照品儲備液，逐級稀釋成質(zhì)量濃度為150,100,75,50,25,4 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述條件進(jìn)樣分析，并記錄峰面積。以雜質(zhì)Ⅰ的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程為：y=543.57x+853.48，r=0.999 0。結(jié)果表明雜質(zhì)Ⅰ在質(zhì)量濃度4～150 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，線性低點(定量限)為4 ng/mL。

2.4.3 進(jìn)樣精密度 取75 ng/mL的雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液20 μL進(jìn)樣分析，同一份溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，計算RSD為1.75%。

2.4.4 重復(fù)性 平行配制75 ng/mL的雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液6份，分別取20 μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算RSD為2.54%。

2.4.5 加樣回收率 精密稱定空白依卡倍特鈉供試品約1 g共6份，置于10 mL量瓶中，分別加入500，750和1 000 ng/mL雜質(zhì)Ⅰ溶液1 mL，加入稀釋劑定容至刻度，不同質(zhì)量濃度同法各配制3份。按上述條件進(jìn)樣分析，結(jié)果經(jīng)計算雜質(zhì)Ⅰ的低、中、高3種質(zhì)量濃度的平均回收率(n=3，%)分別92.07、106.30和95.56，RSD(n=3，%)分別為2.7、1.3和0.5。

2.4.6 耐用性 按照上述加樣回收率試驗中質(zhì)量濃度方法配制加樣供試品溶液；在柱溫變化為±2 ℃，流速變化為±0.2 mL/min及流動相B初始比例變化變化為±5%的試驗條件下進(jìn)樣，分別計算雜質(zhì)Ⅰ的含量。結(jié)果柱溫變化(38，40，42 ℃)，雜質(zhì)Ⅰ含量(×10-4%)分別為0.83、0.80、0.84；流速變化(0.8，1.0，1.2mL/min)，雜質(zhì)Ⅰ含量(×10-4%)分別為0.82、0.80、0.83；流動相B初始比例變化(45%，50%，55%)，雜質(zhì)Ⅰ含量(×10-4%)分別為0.78、0.80、0.86。結(jié)果表明，雜質(zhì)Ⅰ含量變化在±0.1×10-4%內(nèi)，表明本法對柱溫、流速、流動相B初始比例變化的耐用性較好。

2.5 樣品測定

采用本文方法對6批樣品(批號：CPC-055-1702001、CPC-055-1702002、CPC-055-1702003、ZJT-161-1702001、ZJT-161-1702002、ZJT-161-1702003)進(jìn)行雜質(zhì)Ⅰ含量測定，按外標(biāo)法計算雜質(zhì)Ⅰ含量。結(jié)果顯示6批樣品中均未檢出雜質(zhì)Ⅰ。

3 結(jié) 論

雜質(zhì)Ⅰ為有機(jī)酯類，在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)。但由于其在正離子模式下很難裂解，而負(fù)離子模式下易于裂解且碎片穩(wěn)定，因而最終選擇了負(fù)離子檢測模式。離子對的選擇參考了文獻(xiàn)方法[14]，文獻(xiàn)中用于依卡倍特鈉定量的離子為m/z379[M-H]-。依卡倍特鈉母核的準(zhǔn)分子離子m/z379[M-H]-，也正好是雜質(zhì)Ⅰ最容易產(chǎn)生的碎片之一(酯鍵發(fā)生斷裂)。離子對m/z407→379在碰撞能改變的條件下能夠穩(wěn)定出現(xiàn)，因而最后選擇了這一離子對作為雜質(zhì)Ⅰ定量的指標(biāo)。質(zhì)譜的其他參數(shù)對于結(jié)果影響較小，因此采用了常用的默認(rèn)設(shè)置值。

本文合成了依卡倍特鈉原料藥中潛在遺傳毒性雜質(zhì)依卡倍特磺酸乙酯，并對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。同時建立了一種快速靈敏專屬性良好的高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，可以準(zhǔn)確地對依卡倍特鈉商業(yè)樣本中遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，且定量限遠(yuǎn)低于雜質(zhì)限度要求。該方法為依卡倍特鈉原料藥的質(zhì)量(特別是遺傳毒性雜質(zhì))的控制提供了新的思路，未來也可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究依卡倍特鈉中其他潛在的遺傳毒性雜質(zhì)。

參 考 文 獻(xiàn)

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