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    miR-29a促進人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外遷移和侵襲的機制

    2018-07-02 07:27:44湯婷婷朱琴華
    中國藥科大學(xué)學(xué)報 2018年3期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶細(xì)胞系抑制劑

    吳 悠,湯婷婷,朱琴華,金 亮,潘 怡

    (中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,南京 210009)

    乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤,是全世界女性中發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤。乳腺癌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移造成的疾病是絕大多數(shù)乳腺癌患者死亡的根本原因[1],因此尋找抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在藥物十分必要。

    微小核糖核酸(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18~24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[2]。不同的miRNA在腫瘤中的表達情況不同,對腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移也起到不同的作用[3]。研究表明,miR-29a在乳腺癌組織中有所升高,并促進了乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4-5]。因此,本研究考察miR-29a對乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用,研究miR-29a調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的新機制,為抗乳腺癌的藥物篩選提供了實驗依據(jù)和新思路。

    1 材 料

    1.1 試 劑

    DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);Lipofectamine 2000、Trizol試劑(美國Invitrogen公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國CST公司);兔抗人HBP1多克隆抗體(美國SAB公司);miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑、模擬物陰性對照、抑制劑陰性對照、miRNA實時熒光定量RT-PCR定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)公司)。

    1.2 儀 器

    實時熒光定量PCR儀(美國Roche公司);酶標(biāo)儀(美國Biotek公司);顯微圖象采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

    1.3 細(xì) 胞

    人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、人胚腎細(xì)胞系HEK-293T由中國藥科大學(xué)生物技術(shù)中心保存。

    2 方 法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    用含10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達90%以上時,用胰蛋白酶消化,按照1∶3的比例傳代。將細(xì)胞以每孔2×105個的細(xì)胞比例種于6孔板,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

    2.2 RT-qPCR實驗

    用Trizol法提取總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后以cDNA為模板進行qPCR反應(yīng),檢測其中miR-29a和HBP1基因mRNA水平的表達,qPCR反應(yīng)數(shù)據(jù)以循環(huán)閾值(Ct)記錄,實驗結(jié)果利用ΔΔCt法進行計算,miR-29a以u6為內(nèi)參,HBP1以GAPDH為內(nèi)參,相對定量各實驗組樣品內(nèi)miR-29a和HBP1基因的表達(miR-29a和u6的引物來自miRNA實時熒光定量 RT-qPCR 定量試劑盒;HBP1和GAPDH引物序列見表1)。

    Table1 Primer sequences used for qPCR

    Primer Sequence (5'?3')GAPDH-FGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGAPDH-RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGHBP1-FTCATCACCATTGGAAGGAGGAHBP1-RTTGCACCATCCCAAATCATCA

    2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    將miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑、模擬物陰性對照、抑制劑陰性對照(序列見表2)干粉瞬時離心后,用含RNA酶抑制劑的ddH2O溶解,在避光的條件下吹打混勻,配制成終濃度為20 μmol/L的工作液(使用時的終濃度均為100 nmol/L),-20 ℃貯存。取“2.1”項中所述種于6孔板的細(xì)胞,按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染,6 h后更換為新的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

    2.4 劃痕愈合遷移實驗

    將種植于6孔板中的細(xì)胞按照“2.3”項下方法轉(zhuǎn)染24 h后,利用1 mL槍頭在細(xì)胞層中形成劃痕,于0,48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況,隨機選取3處進行拍照。每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。

    Table2 Sequences of miR-29a mimic/inhibitor and their controls

    PrimerSequence (5'?3')miR-29a mimicSenseUAGCACCAUCUGAAAUCG-GUUAAntisenseACCGAUUUCAGAUGGUGC-UAUUControl mimicSenseUUCUCCGAACGUGUCACGUTTAntisenseACGUGACACGUUCG-GAGAATTmiR-29a inhibi-torUAACCGAUUUCAGAUGGUGC-UAControl inhibitorCAGUACUUUUGUGUAGUA-CAA

    2.5 Transwell小室侵襲實驗

    按照“2.3”項下方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,將細(xì)胞進行消化,加入無血清DMEM 培養(yǎng)基吹打混勻,調(diào)整細(xì)胞的濃度為每毫升5×105個,在Transwell小室的下室加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL,在上室加入混勻的細(xì)胞懸液200 μL(在實驗前4~6 h將matrigel膠儲液用無血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基按1∶6進行稀釋,以每孔50 μL的體積加入到Transwell 侵襲小室中),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)36~48 h后,經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min和結(jié)晶紫染色20 min后,用棉簽小心擦去膜上面的細(xì)胞,用顯微圖像采集系統(tǒng)進行觀察并隨機選取視野進行拍照。

    2.6 靶基因預(yù)測和熒光素酶報告實驗

    通過生物信息預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan7.1對miR-29a進行檢索,預(yù)測其靶基因,然后將預(yù)測到的靶基因HBP1作為研究對象。人工合成野生型片段(HBP1-WF/WR),并引入SpeⅠ和HindⅢ 限制性核酸內(nèi)切酶位點;在野生序列基礎(chǔ)上,另外設(shè)計合成了種子序列互補序列的突變位點,合成突變型片段(HBP1-MF/MR)(具體序列見表3,粗體表示酶切位點)。包含目標(biāo)基因的片段經(jīng)退火后導(dǎo)入pMIR-REPORT質(zhì)粒。將生長良好的HEK-293T細(xì)胞種于24孔板中,于24孔板的每一孔中,分別共轉(zhuǎn)染熒光素酶質(zhì)粒(或相對應(yīng)的突變質(zhì)粒)1 μg、海腎熒光素酶質(zhì)粒0.3 μg以及相應(yīng)量的miR-29a模擬物或miR-29a抑制劑或各自對應(yīng)的陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后按照試劑盒說明書檢測熒光水平以及進行數(shù)據(jù)計算。

    Table3 Primer sequences used for luciferase report assay

    2.7 Western blot實驗

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞裂解提取蛋白,加入上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,將膜置于含50 g/L脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h;再分別加入相應(yīng)的兔抗人HBP1抗體及兔抗人GAPDH 抗體,4 ℃過夜,次日以TBST洗滌3次,加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,ECL顯色系統(tǒng)定影顯色,觀察條帶并進行灰度掃描。以GAPDH作為內(nèi)參對照。

    2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    3 結(jié) 果

    3.1 miR-29a在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達

    MDA-MB-231屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞系,MCF-7為原位ER陽性乳腺癌細(xì)胞系,惡性程度較MDA-MB-231低,本研究比較了不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-29a的表達水平。RT-qPCR檢測結(jié)果(圖1)顯示,miR-29a在MDA-MB-231中的表達明顯高于在MCF-7中,miR-29a在惡性程度更高的MDA-MB-231中表達較高提示miR-29a的潛在促腫瘤作用。

    ***P<0.001vsMCF-7 group

    3.2 過表達和敲除miR-29a的轉(zhuǎn)染效率驗證

    將miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑及其陰性對照轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,RT-qPCR檢測結(jié)果(圖2)顯示,與模擬物陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物的細(xì)胞中miR-29a的表達水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與抑制劑陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-29a抑制劑的細(xì)胞中miR-29a的表達水平下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義??傊?,以上結(jié)果說明有效地實現(xiàn)了miR-29a的過表達和敲除。

    ***P<0.001vscontrol mimic group;*P<0.05vscontrol inhibitor group

    3.3 miR-29a對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外侵襲和遷移的促進作用

    體外遷移實驗結(jié)果顯示,與模擬物陰性對照組相比,過表達miR-29a的細(xì)胞劃痕間隙變化顯著升高(圖3-A);與抑制劑陰性對照組相比,敲除miR-29a的細(xì)胞劃痕間隙變化顯著降低(圖3-B)。體外侵襲實驗結(jié)果顯示,過表達miR-29a的細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)增多(圖4-A);相應(yīng)的,敲除miR-29a的細(xì)胞侵襲數(shù)減少(圖4-B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3.4 靶基因預(yù)測及HBP1的熒光素酶驗證

    通過預(yù)測分析,miR-29a序列與HBP1 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)存在一個互補結(jié)合區(qū),HBP1可能為miR-29a的特異性靶基因。本研究進行了熒光素酶報告實驗,實驗結(jié)果(圖5)表明HBP1為miR-29a的直接靶基因,miR-29a與HBP1的3′-UTR區(qū)存在直接靶向作用。

    3.5 Western blot和RT-qCR檢測HBP1蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達

    Western blot結(jié)果(圖6)顯示,過表達和敲除miR-29a分別可下調(diào)和上調(diào)HBP1在蛋白水平的表達。然而,RT-qPCR結(jié)果(圖7)顯示,miR-29a的過表達和敲除對HBP1的mRNA水平?jīng)]有影響。

    Figure3 Effects of miR-29a mimic (A) and inhibitor (B) on the migration of MCF-7 cells

    Figure4 Effects of miR-29a mimic (A,36 h) and inhibitor (B,48 h) on the invasion of MCF-7 cells

    **P<0.01vscontrol mimic/WT group;*P<0.05vscontrol inhibitor/WT group

    Figure6 Effects of miR-29a mimic (A) and inhibitor (B) on the protein expression of HBP1 in MCF-7 cells

    4 討 論

    miRNA參與細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞周期等多種生物過程。miRNA主要通過結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)來控制其靶mRNA的表達,單個基因的UTR區(qū)可以具有多個miRNA的結(jié)合位點或者某一個miRNA的多個結(jié)合位點,這表明由這些miRNA通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因表達[6]。

    miR-29a位于染色體7q32.3負(fù)鏈的普通型脆性位點FRA7H內(nèi),可能與腫瘤密切相關(guān)[7]。miR-29a被報道在多種腫瘤中低表達且是抑癌因子,如胃癌[8]、胰腺癌[9]、宮頸癌[10]、前列腺癌[11]、食管癌[12]等;然而miR-29a也被報道在乳腺癌[4]、結(jié)腸癌[13]中表達上調(diào),作為促癌基因促進了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本研究首先通過實時熒光定量RT-qPCR檢測了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-29a的表達水平,發(fā)現(xiàn)與MCF-7細(xì)胞相比,miR-29a在MDA-MB-231中的表達上調(diào),因為相比MCF-7細(xì)胞,MDA-MB-231轉(zhuǎn)移性和惡性程度更高,這提示miR-29a在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能起促進的作用。為了進一步明確miR-29a在乳腺癌中的作用,本研究以MCF-7細(xì)胞作為研究對象,通過脂質(zhì)體法將miR-29a mimic及miR-29a inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,通過劃痕實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比較,轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后細(xì)胞的遷移和侵襲的能力增加,而轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后細(xì)胞的遷移和侵襲的能力減少,這表明miR-29a對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力具有正向調(diào)控作用。

    此外,為了進一步研究miR-29a調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機制,本研究用目前常用的miRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan 7.1對miR-29a的靶基因進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)HBP1的3′-UTR區(qū)域存在與miR-29a不完全配對的序列,這說明HBP1有可能是miR-29a的靶基因。HBP1(HMG盒轉(zhuǎn)錄因子1),是一種核蛋白,人體多種組織中均有表達[14],如大腦、子宮、睪丸、肺以及心臟等。HBP1是一種重要的腫瘤抑制因子,其抑制腫瘤機制有多種[15]:HBP1抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的活性及表達;通過與p38-MAPK通路作用調(diào)控細(xì)胞周期的阻滯;參與Ras介導(dǎo)的早衰;HBP1還可阻滯Wnt-β連環(huán)蛋白信號通路從而抑制G1進程,進而抑制腫瘤細(xì)胞生長。一些臨床研究表明,在浸潤性乳腺癌中發(fā)生HBP1的突變或表達減少,并且HBP1可能調(diào)節(jié)幾種類型的乳腺癌的增殖和侵襲[16-17]。HBP1是通過抑制LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子抑制Wnt/b-catenin信號傳導(dǎo)[18],而Wnt信號通路是會進一步影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的[19-20]。綜合以上幾點推測,HBP1通過Wnt信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,因此選擇HBP1基因作為下一步研究的對象。

    為了驗證miR-29a與HBP1之間是否存在調(diào)控的關(guān)系,本研究先進行了熒光素酶報告基因驗證實驗,發(fā)現(xiàn)miR-29a直接與HBP1基因的3′-UTR區(qū)域相結(jié)合,然后又檢測了miR-29a變化后HBP1的表達情況。Western blot結(jié)果顯示,與陰性對照組相比較,當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后,HBP1蛋白質(zhì)的表達下調(diào),而細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后,HBP1蛋白質(zhì)的表達上調(diào),說明miR-29a可負(fù)向調(diào)控HBP1蛋白的表達。然而,RT-qPCR的結(jié)果顯示,過表達或敲除miR-29a后,HBP1在mRNA水平上的表達沒有變化,說明miR-29a調(diào)控HBP1的表達是通過結(jié)合HBP1的mRNA抑制其蛋白水平表達,而非使其mRNA降解,這符合miRNA調(diào)控靶基因的一般規(guī)律。

    綜合以上實驗結(jié)果,本研究推測,在乳腺癌中高表達的miR-29a通過下調(diào)HBP1,從而使乳腺癌細(xì)胞獲得高的遷移和侵襲能力,促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移,其具體機制可能是通過Wnt信號通路,還有待進一步實驗研究確認(rèn)。

    參 考 文 獻

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