朱 杰 王慧琴 趙宗峰 張 慧 康曉靜 吳衛(wèi)東

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，是臨床表型、遺傳、環(huán)境和免疫因素相互作用的結(jié)果。四十多年的臨床和基礎(chǔ)研究闡明了銀屑病的許多潛在致病機制。目前已有研究證明miR-34a-5p參與細胞自噬和細胞衰老的調(diào)節(jié)[1-3]，且miR-34a-5p及其靶基因Notch1在銀屑病皮損中的表達呈正相關(guān)性[4]，然而miR-34a-5p對人角質(zhì)形成細胞生物學(xué)性狀的影響尚不清楚，故本實驗在前期研究基礎(chǔ)上進一步驗證miR-34a-5p對HaCaT細胞增殖的影響，以及對靶基因Notch1調(diào)控情況的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 miR-34a-5p模擬物、抑制物及SiRNA均有Qiagen公司設(shè)計合成，HaCaT細胞株(購自于上海富衡生物科技有限公司培養(yǎng)的銀屑病患者外周正常皮膚角質(zhì)細胞)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(德國Gibco公司)，0.25%的胰酶，轉(zhuǎn)染試劑、RNA抽提試劑盒(均購于Qiagen公司)，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，熒光定量PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細胞，待HaCaT細胞生長至80%～90%融合時，用胰酶將培養(yǎng)的細胞制備成單細胞懸液，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑濃度 如表1配置3組轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后2 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細胞的死亡率、轉(zhuǎn)染效率，選出最佳轉(zhuǎn)染濃度。

表1 根據(jù)SiRNA選擇最佳轉(zhuǎn)染試劑濃度

1.2.3 MTT(CCK-8試劑)檢測轉(zhuǎn)染后HaCaT細胞的增殖活力 制備HaCaT單細胞懸液1.5～3.5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后，根據(jù)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑濃度分5組進行轉(zhuǎn)染：mimic組、NC組、inhibitor組、inhibitor NC組、空白對照組(只添加培養(yǎng)基)，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)6、24、48、72 h后終止培養(yǎng)。避光條件下每孔加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h，在酶標儀上測定450 nm波長處的吸光度值(OD值)，實驗重復(fù)3次，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線并計算細胞增殖活力，細胞活力=(處理組-空白對照組)/(NC組-空白對照組)×100%。

1.2.4 提取細胞總RNA 共設(shè)4組進行轉(zhuǎn)染，即mimic組，NC組，inhibitor組，inhibitor NC組。根據(jù)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染濃度配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)然后48 h,用miRNeasy Mini kit分別抽提4組細胞的總RNA。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄熒光定量(RT-qPCR) 根據(jù)miScript-II-RT-Kit-EN-反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將4組RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA,每組設(shè)置三個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參擴增Notch1.通過PCR儀的系統(tǒng)軟件得出內(nèi)參基因和目的基因的Ct值，再計算出4組的△Ct值，△△Ct值以及2-△△Ct，比較4組間基因表達的差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a-5p對人HaCaT細胞活力的影響 MTT法檢測結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染空白對照組相比，在不同時間點不同濃度的mimic組MTT實驗OD值均有升高，轉(zhuǎn)然后48 h，mimic組、inhibitor組、inhibitor NC組HaCaT細胞的增殖活力分別為：39.7%、15.7%、20.7%，與NC組(21.3%)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)然后mimic組HaCaT細胞增殖活力明顯增強，inhibitor組HaCaT細胞增殖活力下降，NC組和inhibitor NC組HaCaT細胞增殖活力與空白對照組相比無明顯變化。

a：轉(zhuǎn)染前 b：轉(zhuǎn)染后2小時 c：轉(zhuǎn)染后2小時熒光顯微鏡下

根據(jù)圖a和圖b比較轉(zhuǎn)染前后死亡細胞數(shù)，評估細胞死亡率<10%，根據(jù)圖b和圖c比較轉(zhuǎn)染后普通顯微鏡及熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染成功細胞數(shù)，評估轉(zhuǎn)染效率>75%,故當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑為3 μL時，即可達最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率。

圖1 HiPerFect Reagent 3 μL時，轉(zhuǎn)染前后細胞情況

表2 轉(zhuǎn)染后各組Notch1的表達量

3 討論

最新的研究表明銀屑病有一個特定的miRNA表達譜，miRNA-217、181 b、146 a等均參與銀屑病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[5-7]。本課題組前期研究顯示與正常皮損相比miRNA-34a在銀屑病皮損組織中表達增高,表現(xiàn)為表皮全層高表達[4]。miRNA-34a通過次氮基三乙酸鐵誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進癌組織中血管再生，且miRNA-34a有促進細胞增殖的作用[8]，這與銀屑病皮損中血管迂曲擴張、細胞過度增殖的特點相一致，并與本實驗結(jié)果相符。本實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了miRNA-34a-5p mimic的HaCaT細胞增殖活力明顯增強，轉(zhuǎn)染了miRNA-34a-5p inhibitor的HaCaT細胞增殖活力明顯下降，兩組與NC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miRNA-34a-5p能促進HaCaT細胞增殖。

Notch1是miRNA-34a-5p靶基因之一。參與調(diào)控細胞的基因調(diào)控機制，包括細胞命運決定、干細胞維持、增殖、分化和存活[9，10]。文獻報道Notch1在正常組織和銀屑病皮損中均有表達，但在銀屑病皮損中表達更高，Notch1在細胞核表達可以加劇銀屑病惡化[11]。故Notch1參與銀屑病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。本實驗結(jié)果顯示，HaCaT細胞轉(zhuǎn)染后，mimic組和inhibitor組Notch1表達量分別為2.78±1.30和0.37±0.46，與NC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此推測miRNA-34a-5p參與對Notch1的調(diào)控作用，miRNA-34a在人HaCaT細胞中有上調(diào)Notch1的作用。綜上所述，miRNA-34a可促進人HaCaT細胞增殖，上調(diào)Notch1 mRNA表達，故miRNA-34a促進HaCaT細胞增殖的機制可能與Notch1表達上調(diào)有關(guān)。

由此推測，下調(diào)miRNA-34a-5p以抑制下游靶基因Notchl表達，可能對銀屑病的發(fā)展過程有一定的抑制作用。以miRNA-34a-5p為靶點來進行研究，有望為尋常型銀屑病的發(fā)病機制及治療的研究提供一個新的思路，為本課題組進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

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