青花菜P450CYP79F1全長(zhǎng)克隆、表達(dá)及其與不同器官中萊菔硫烷含量的相關(guān)性分析

李占省，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊木，張揚(yáng)勇，呂紅豪

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青花菜P450全長(zhǎng)克隆、表達(dá)及其與不同器官中萊菔硫烷含量的相關(guān)性分析

李占省，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊木，張揚(yáng)勇，呂紅豪

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【目的】克隆青花菜細(xì)胞色素家族P450，分析其序列特征，闡明其在不同發(fā)育時(shí)期器官中的表達(dá)情況及其與萊菔硫烷含量的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示萊菔硫烷合成機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為青花菜品種改良和新品種選育奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)5′和3′端RACE克隆技術(shù)獲得青花菜全長(zhǎng)序列，利用DNAMAN 6.0進(jìn)行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)合在線分析程序和軟件進(jìn)行基因和編碼蛋白生物信息學(xué)分析；利用熒光定量PCR技術(shù)研究在不同發(fā)育器官中的表達(dá)情況；結(jié)合HPLC方法測(cè)定各相應(yīng)時(shí)期器官中萊菔硫烷含量，包括青花菜發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉，成熟花球，抽薹期花蕾（頂端蕾、成熟蕾、開花前1 d的蕾和花）和種子；對(duì)表達(dá)量與和萊菔硫烷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。【結(jié)果】獲得了全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)為MG012890，該基因全長(zhǎng)2 014 bp，包含一個(gè)1 620 bp的開放讀碼框（ORF），編碼540個(gè)氨基酸；編碼的蛋白與甘藍(lán)、白菜、芥藍(lán)和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上；生物信息學(xué)分析表明該基因編碼的酶蛋白有2個(gè)信號(hào)肽和2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性穩(wěn)定蛋白，Wolf Psort預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中；在根和莖中的表達(dá)量較高，葉中表達(dá)量最低，在花器官發(fā)育時(shí)期，自頂端蕾到花發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸降低的表達(dá)趨勢(shì)，種子中該基因表達(dá)量與花處于同一水平。相關(guān)性分析顯示，青花菜發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉、成熟花球、抽薹期花蕾和種子中萊菔硫烷含量與表達(dá)量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，但抽薹期花蕾自頂端花蕾到花中萊菔硫烷生成量與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（=0.96，<0.05），在調(diào)控萊菔硫烷的生成方面起重要作用，尤其是在生殖器官花蕾的發(fā)育過(guò)程中，能夠顯著上調(diào)萊菔硫烷的生成量。【結(jié)論】在青花菜不同發(fā)育器官中對(duì)萊菔硫烷的生成發(fā)揮著重要調(diào)控作用，可能與青花菜不同器官中萊菔硫烷含量多樣性密切相關(guān)。

青花菜；萊菔硫烷；；表達(dá)分析；HPLC

0 引言

【研究意義】青花菜（var.）又名西蘭花、綠菜花等，十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜變種，一、二年生植物。青花菜營(yíng)養(yǎng)全面，富含多種礦物質(zhì)和維生素，同時(shí)富含4-甲?；鶃喕酋；』蜻埃╣lucoraphanin，GRA），4-甲?；鶃喕酋；』蜻澳鼙晃挥谝号葜械暮诮孀用杆馍僧惲蚯杷猁}類物質(zhì)——萊菔硫烷（sulforaphane，SF或SFN）。流行病和臨床醫(yī)學(xué)研究表明，萊菔硫烷能夠顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌等多種癌癥的患病率[1-7]，在降低糖尿病、高血壓和心腦血管疾病等發(fā)病率方面具有很好的醫(yī)學(xué)前景[8-11]。據(jù)報(bào)道，青花菜不同器官中萊菔硫烷含量差異較大，不同基因型材料也存在顯著差異，種子中萊菔硫烷含量最高，芽苗在前期（5—7 d）含量較高，后期降低，花球中萊菔硫烷含量高于幼莖，葉片最低。另有研究表明，青花菜葉片中萊菔硫烷含量處于較高水平，這可能由不同發(fā)育時(shí)期的樣品和基因型造成[12-18]。擬南芥研究結(jié)果表明，為萊菔硫烷代謝的上游調(diào)控基因，在萊菔硫烷的合成方面可能具有重要作用[19-22]。因此克隆青花菜該基因全長(zhǎng)，分析其在青花菜不同發(fā)育時(shí)期各器官中的表達(dá)量與萊菔硫烷含量的相關(guān)性，將為進(jìn)一步闡明青花菜萊菔硫烷含量分布的器官多樣性提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)青花菜不同器官的科學(xué)利用和新品種選育都具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】擬南芥硫甙代謝研究表明，能夠?qū)㈤L(zhǎng)鏈或短鏈甲硫氨酸催化形成相應(yīng)的醛肟，尤其是短鏈脂肪酸（1C-4C）的合成尤為重要[19,21]。萊菔硫烷的前體為4-甲基亞磺?；』蜻?，為短鏈脂肪酸合成途徑，因此，在調(diào)控4-甲基亞磺?；』蜻暗纳煞矫嬗葹橹匾?。另外，過(guò)表達(dá)能夠調(diào)控?cái)M南芥株高（變矮）和植株大小，且與根部發(fā)育也具有直接的調(diào)控作用[23-25]。王紅波等[26]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究指出，的過(guò)表達(dá)能夠顯著增加4-甲基亞磺?；』蜻昂浚胚峤M硫甙成分則相對(duì)降低，暗示該基因與脂肪族硫甙和萊菔硫烷代謝密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)能夠增加脂肪族硫甙成分在擬南芥上同樣得到了證實(shí)[25,27-28]。【本研究切入點(diǎn)】青花菜富含抗癌活性成分萊菔硫烷已逐漸被大眾認(rèn)知，青花菜不同器官中萊菔硫烷含量多樣性分布的原因目前尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從青花菜中克隆獲得全長(zhǎng)，分析其家族序列特征，研究其在青花菜不同發(fā)育時(shí)期各器官中的表達(dá)特性與萊菔硫烷含量相關(guān)性，為深入研究青花菜不同器官中萊菔硫烷代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年8月至2017年7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

青花菜材料B691為純合自交系材料（自交16代），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)青花菜課題組選育。

試驗(yàn)材料于2015年8月中旬定植于露地，每份材料設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)種植11株，行間距為45 cm×55 cm。2015年10月初開始對(duì)試驗(yàn)材料的根、莖、葉、發(fā)育時(shí)期的花球進(jìn)行取樣，待植株移栽到溫室后，對(duì)抽薹期的花蕾（頂端蕾、成熟蕾、開花前1 d蕾和花）進(jìn)行取樣。相同材料保存2份，一份于超低溫保存后真空冷凍干燥，機(jī)械粉碎后密封保存；另一份提取總RNA進(jìn)行定量表達(dá)分析。

1.2 青花菜CYP79F1克隆

青花菜總RNA的提取采用Trizol法，RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒）均由日本TaKaRa公司購(gòu)置。按照TaKaRa試劑盒要求除去痕量DNA的總RNA，進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。5′-RACE cDNA第一鏈的合成：根據(jù)Invitrogen公司Gene- RacerTM試劑盒要求進(jìn)行總RNA的脫磷、脫帽處理，然后在5′端加上RNA Oligo，利用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ，以基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（表1）。3′-RACE cDNA第一鏈合成仍參照Gene-RacerTM試劑盒要求進(jìn)行，所需引物信息見表1。

cDNA核心克隆則參照?qǐng)?bào)道的已知序列（Genebank：KP693683）設(shè)計(jì)核心引物（表1）。反應(yīng)體系為：Taq 2X Master Mix（百泰克）25 μL，正向引物（10 μmol?L-1）1 μL，反向引物（10 μmol?L-1）1 μL，cDNA模板（80—100 ng）1 μL，雙蒸水22 μL，共50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。從反應(yīng)產(chǎn)物中取10 μL在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。

將所有擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并與Blunt Zero Cloning載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，送至華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與保守區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)拼接。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0進(jìn)行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，在線NCBI進(jìn)行序列處理（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/，Vecscreen）與分析，Blastx和Blastp分析，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析（http://web.expasy.org/protparam/，ProtParam）和修飾分析（http://myhits.isb-sib.ch/ cgibin/motif_scan，MotifScan），跨膜預(yù)測(cè)分析（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，TMHMM），系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建在線分析（NCBI），亞細(xì)胞定位在線分析（https:// omictools.com/wolf-psort-tool，WoLF PSORT）。

1.4 青花菜CYP79F1表達(dá)分析

利用軟件Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列為雙向引物為F（5′-3′）：GTCACGCCAGACG AAATCAAA和R（5′-3′）：GCACAAGCCTGTCTTTT CCAACT，目標(biāo)長(zhǎng)度為169 bp，內(nèi)參基因?yàn)?12，引物序列F（5′-3′）：GGCTCTATCTTGGCTTCTCTCA GT和（5′-3′）：CCAGATTCATCATACTCGGCTTT。參照TaKaRa SYBR? Green PCR Master Mix說(shuō)明進(jìn)行操作，在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：25 μL SYBR? Premix，5 μL cDNA模板，雙向引物各1 μL，1 μL Rox，加蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，每樣品各設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線和熒光值變化曲線分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

表1 CYP79F1擴(kuò)增引物信息

采用實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)各樣品加樣量均為2 μL，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等影響，每個(gè)樣品2 μL的cDNA含量并不完全相同，為校正此差異，使用內(nèi)參基因（不同樣品間表達(dá)量基本恒定）進(jìn)行校正。根據(jù)Real-time PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2-△△ct相對(duì)定量法計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果[16]。

1.5 萊菔硫烷含量的提取與HPLC分析

青花菜不同器官中萊菔硫烷含量的提取與HPLC分析參照李占省等[17,29]的方法進(jìn)行。

1.6 相關(guān)性分析與數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，將青花菜不同發(fā)育時(shí)期各器官中基因的表達(dá)量與萊菔硫烷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，具體采用相關(guān)性分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行基本處理，方差分析和卡方檢驗(yàn)采用SPSS 17.0軟件，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SD，n=3）表示，one-way ANOVA用于顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法分析（<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 青花菜CYP79F1全長(zhǎng)克隆

根據(jù)PCR產(chǎn)物5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并拼接，長(zhǎng)度為2 014 bp的序列（圖1），前邊包含62個(gè)非編碼區(qū)，從63處開始翻譯，到1 685 bp處終止，將拼接后的序列在線Blastx分析（NCBI），結(jié)果如圖2所示，其中的小寫字母通常被設(shè)定為沒(méi)有三維結(jié)構(gòu)的氨基酸。核心cDNA序列包含一個(gè)完整的1 620 bp的開放閱讀框（open reading flame，ORF），5′端有62 bp的非翻譯區(qū)（untranslate region，UTR），富含A和T，A（597）和T（541）的總含量達(dá)56.5%，G（459）和C（417）含量占總含量的43.5%。經(jīng)DNAMAN 6.0分析和NCBI在線Blastx分析（圖2），該基因編碼區(qū)編碼一條540個(gè)氨基酸殘基的多肽，分子量61.434 kD，等電點(diǎn)8.29，pH 7.0時(shí)的帶電荷數(shù)（ch）為6.63，3′端具有完整的Poly A尾巴。該基因檢測(cè)到2個(gè)甲基化位點(diǎn)，DAM甲基化酶對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為GATC 2-A，DCM甲基化酶對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為CCWGG 2-C。該基因序列已在GenBank注冊(cè)，登記號(hào)為MG012890。

2.2 CYP79F1編碼蛋白質(zhì)的特性分析

該基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)22個(gè)抗原肽段，其分值和長(zhǎng)度變化分別為1.03—1.19和6—31個(gè)氨基酸。

1—4代表3端′端RANCE克隆，6—7為核心區(qū)克隆，8—9為5′端RANCE克隆，M為5000 bp

圖2 CYP79F1與甘藍(lán)型油菜blastx比對(duì)分析結(jié)果

經(jīng)氨基酸特性分析，構(gòu)成蛋白質(zhì)中共存在20種氨基酸，賴氨酸（Leu）含量最高（10.3%），其次是精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu），分別占6.9%，然后依次是甘氨酸（Gly）（6.5%）、異亮氨酸（Ile）和丙氨酸（Ala）（6.3%），色氨酸（Trp）含量最低，為1.5%。就構(gòu)成氨基酸的特性而言，該蛋白包含82個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（H、K和R），66個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D和E），240個(gè)疏水氨基酸（A、F、I、L、M、P、V和W）和152個(gè)極性氨基酸（C、G、N、Q、S、T和Y），預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白（親水平均值-0.11，疏水平均值-0.26）。

Blastp搜索顯示，CYP79F1屬于細(xì)胞色素家族P450超級(jí)家族，編碼540個(gè)氨基酸。Motif Scan 分析顯示，該蛋白存在細(xì)胞色素P450C半胱氨酸血紅素-iron配體信號(hào)（Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature），位于第469—478氨基酸處。PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，該蛋白存在2處酰胺化位點(diǎn)（AMIDATION Amidation site），207—210和471—474；6處酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（CK2_ PHOSPHO_SITE Casein kinase II phosphorylation site），246—249、307—310、318—321、344—347、458—461和509—512；4處N-豆蔻酰化位點(diǎn)（MYRISTYL N-myristoylation site），129—134、293—298、428—433和478—483。此外發(fā)現(xiàn)，6處蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（PKC_PHOSPHO_SITE Protein kinase C），156—158、202—204、307—309、390—392、432—434和471—473；1處酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（TYR_PHOSPHO_SITE Tyrosine kinase phosphorylation site），434—442。

TMHMM顯示，該蛋白為跨膜蛋白，存在2處跨膜區(qū)，第一個(gè)位于編碼氨基酸7—35處，包含29個(gè)氨基酸；第二個(gè)位于編碼氨基酸472—500處，包含29個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)詳見圖3。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為：45%的H（alpha-helix）、6%的E（beta-sheet）和47%的C（loop或coil）。利用SWISSMODEL對(duì)青花菜CYP79F1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，詳見圖4。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 CYP79F1 蛋白的同源比對(duì)分析

同源分析表明，該CYP79F1蛋白與十字花科作物中的甘藍(lán)型油菜（）、野生甘藍(lán)（）、芥藍(lán)（var）、白菜（）和蘿卜（）等氨基酸序列高度同源，相似性分別為99%、99%、99%、97%和95%，其次是十字花科的菘藍(lán)（），又名北板藍(lán)根，相似性為94%，這為分析兩種基于該基因代謝中的相似成分與調(diào)控機(jī)理提供了依據(jù)[30]。

2.4 CYP79F1的表達(dá)分析

定量表達(dá)分析顯示，在青花菜的根和莖中表達(dá)量最高，其次是頂端蕾、開花前1 d蕾、成蕾、花、葉和花球，種子中該基因的表達(dá)量與抽薹期花中的表達(dá)量處于同一水平（圖5）。從花蕾發(fā)育期可以看出，該材料自頂端蕾到花的發(fā)育過(guò)程中基本呈現(xiàn)逐漸降低的表達(dá)趨勢(shì)，該結(jié)果已經(jīng)多次驗(yàn)證并報(bào)道[16,31]，暗示與花器官發(fā)育和激素代謝密切相關(guān)，其調(diào)控機(jī)理需要深入研究。

2.5 青花菜中萊菔硫烷含量HPLC分析

HPLC分析表明，青花菜不同發(fā)育時(shí)期各器官中萊菔硫烷含量差異顯著（<0.05）（圖6）。結(jié)果表明，種子中萊菔硫烷含量最高，平均含量為4 855.64 mg?kg-1DW，與當(dāng)前報(bào)道一致[14-18]?；ㄆ鞴侔l(fā)育時(shí)期總體含量處于較高水平，平均值為1 027.35 mg?kg-1DW，含量最高的為頂端花蕾（1 327 mg?kg-1DW），然后依次是成蕾（1 001.81 mg?kg-1DW）、開花前1 d蕾（994.39 mg?kg-1DW）和花（786.20 mg?kg-1DW），其余器官中，花球（456.45 mg?kg-1DW）高于幼莖（282.86 mg?kg-1DW），葉片（160.46 mg?kg-1DW）中萊菔硫烷含量處于較低水平，根中萊菔硫烷含量最低（17.73 mg?kg-1DW）。同時(shí)，萊菔硫烷含量檢出值在花器官發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，表現(xiàn)為頂端花蕾發(fā)育到花的過(guò)程中呈逐漸降低的趨勢(shì)，頂端蕾中含量最高，是根中萊菔硫烷檢出值的75倍，暗示萊菔硫烷含量合成與植物分化可能存在一定的關(guān)系。

圖3 CYP79F1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

A和B分別代表不同角度的3D圖 Different points of 3D view shown by A and B

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercases indicated significant differences at P＜0.05 level. The same as below

圖6 青花菜不同器官中萊菔硫烷含量HPLC分析

2.6 青花菜不同發(fā)育器官中萊菔硫烷含量與CYP79F1表達(dá)量相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，表達(dá)量與根、莖、葉、花球、頂端蕾、成蕾、開花前1 d蕾、花和種子中萊菔硫烷生成量間的相關(guān)系數(shù)為-0.273，負(fù)相關(guān)性不顯著（=0.478）（表2）。為了明確頂端花蕾發(fā)育到花的過(guò)程中萊菔硫烷含量逐漸降低是否與表達(dá)量具有顯著相關(guān)性，將該發(fā)育時(shí)期的萊菔硫烷含量與對(duì)應(yīng)器官的基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.959（=0.041）（表3）。表明在青花菜花器官發(fā)育中與萊菔硫烷的積累具有明顯相關(guān)性，可能發(fā)揮了直接調(diào)控作用。

表2 不同器官中萊菔硫烷含量與基因表達(dá)量相關(guān)性分析

表3 抽薹期花蕾萊菔硫烷含量與基因表達(dá)量相關(guān)性分析

*表示顯著相關(guān)（＜0.05）

* indicate significant correlation (＜0.05)

3 討論

在調(diào)控脂肪族硫甙合成方面發(fā)揮著重要作用，與青花菜中萊菔硫烷生成量密切相關(guān)，同時(shí)在植物發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[14,20-21,23]。目前，擬南芥中已經(jīng)克隆該基因（AT1G16410），該基因?qū)儆诩?xì)胞色素家族P450成員，在基因組中的長(zhǎng)度為3 383 bp，其cDNA為1 200 bp。油菜中該基因位于基因組scaffold_526區(qū)域內(nèi)，該scaffold DNA全長(zhǎng)為436 263 bp。青花菜基因組不同于擬南芥和油菜，存在多倍化和重組事件，同時(shí)不同變種之間往往存在基因變異的可能，而青花菜中有關(guān)該基因與萊菔硫烷方面的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)RACE技術(shù)，從青花菜中獲得mRNA全長(zhǎng)為2 014 bp，同源比對(duì)結(jié)果表明，該序列與擬南芥、油菜基因相似性分別為86%和99%，與油菜親緣關(guān)系更近，表明該基因在蕓薹屬異源四倍體基因組中能夠穩(wěn)定遺傳，暗示了其在進(jìn)化和重組中的保守性。經(jīng)在線分析（NCBI），與該基因同源的還有芥藍(lán)和野生甘藍(lán)，其相似性均為99%，再次驗(yàn)證了該克隆的準(zhǔn)確性和保守性[32]。

目前，功能已在擬南芥和部分蕓薹屬作物中獲得驗(yàn)證[19,21]。本研究預(yù)測(cè)青花菜中亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，與當(dāng)前報(bào)道一致，同時(shí)，編碼蛋白為親水性跨膜蛋白，存在2處跨膜區(qū)，各含有3個(gè)P450信號(hào)序列，含有2個(gè)信號(hào)肽序列，這與擬南芥上有關(guān)該基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)揮功能的定位與結(jié)論一致[21,33]。此外，本研究揭示了該編碼蛋白存在2處酰胺化位點(diǎn)，6處酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，4處N-豆蔻?；稽c(diǎn)，6處蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1處酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，這方面研究尚未見報(bào)道，該發(fā)現(xiàn)為深入研究CYP79F1高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能修飾位點(diǎn)提供了依據(jù)和支持[34]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在青花菜不同發(fā)育器官中存在明顯的表達(dá)特異性，萊菔硫烷的生成量在不同器官存在多樣性。在根中和莖中表達(dá)量較高，但相應(yīng)器官中萊菔硫烷含量并不是處于較高水平，種子中萊菔硫烷含量處于最高水平，但其表達(dá)量并不高。相關(guān)性分析結(jié)果表明，青花菜發(fā)育不同發(fā)育時(shí)期的器官中，表達(dá)量與萊菔硫烷的生成量沒(méi)有顯著相關(guān)性，但在抽薹期發(fā)育的花蕾中則呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，暗示該基因在花器官發(fā)育過(guò)程中可能直接參與了萊菔硫烷的代謝調(diào)控，該發(fā)現(xiàn)也為少數(shù)報(bào)道該基因間接參與植物激素代謝和細(xì)胞分化途徑提供了參考[35-37]。

由此可見，青花菜發(fā)育時(shí)期不同器官中萊菔硫烷含量多樣性是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和運(yùn)輸機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，在生殖器官中總體表達(dá)較為活躍，而在營(yíng)養(yǎng)器官種呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，營(yíng)養(yǎng)器官中萊菔硫烷HPLC檢測(cè)值明顯低于生殖器官（花器官和種子），暗示在調(diào)控萊菔硫烷的生成量方面發(fā)揮了重要調(diào)控作用，但營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官間是否存在萊菔硫烷的主動(dòng)運(yùn)輸關(guān)系，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，為脂肪族硫甙上游調(diào)控基因，尤其是能夠直接調(diào)控3C和4C脂肪族硫甙生成，而對(duì)應(yīng)的下游硫甙包括GRA、PRO、NAP等，這些硫甙成分與青花菜等十字花科蔬菜（作物）的風(fēng)味、植保和營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)，因此該基因可能在十字花科蕓薹屬作物中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[38-41]。本研究結(jié)論為深入研究與蕓薹屬作物硫甙成分與風(fēng)味奠定了基礎(chǔ)。與細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，這與擬南芥中報(bào)道的該基因能夠調(diào)控?cái)M南芥株高和大小的結(jié)論相一致[36-37]，也暗示了可能參與了多個(gè)代謝途徑的調(diào)控。

4 結(jié)論

利用RACE技術(shù)從青花菜中獲得了全長(zhǎng)（2 014 bp），ORF為1 620 bp，編碼540個(gè)氨基酸。該基因?qū)儆赑450基因超家族，各含有3個(gè)P450信號(hào)序列，含有2個(gè)信號(hào)肽序列，屬于親水性跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，其編碼的蛋白與油菜、芥藍(lán)和野生甘藍(lán)等蕓薹屬蔬菜具有高度同源性。在青花菜不同發(fā)育器官中存在明顯的表達(dá)特異性，在營(yíng)養(yǎng)器官根和莖中表達(dá)量最高，其次是花器官發(fā)育時(shí)期，總體處于較高水平，與花器官發(fā)育呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)合各時(shí)期發(fā)育器官中萊菔硫烷含量變化，推測(cè)該基因通過(guò)組織表達(dá)特異性，可能直接參與調(diào)控青花菜不同發(fā)育器官中萊菔硫烷的生成和積累。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Full Length Cloning, Expression and Correlation Analysis of P450Gene with Sulforaphane Content in Different Broccoli Organs

LI ZhanSheng, LIU YuMei, FANG ZhiYuan, YANG LiMei, ZHUANG Mu, ZHANG YangYong, Lü HongHao

(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biological and Genetic Improvement of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【Objective】The aim of this study was to clone the full length of P450 familygene from broccoli, investigate its sequence characteristic and analyze its expression and correlation with sulforaphane content in different developmental broccoli organs. These findings will provide a scientific basis for further revealing the mechanism of sulforaphane metabolism in broccoli and lay a practical foundation for the genetic improvement and breeding of broccoli varieties. 【Method】 The full length sequence ofgene was obtained by RACE cloning (5′ and 3′). According to the software of DNAMAN 6.0, gene splicing, amino acid sequence analysis and protein secondary structure prediction ofgene, at the same time, bioinformatics information was also predicted by online program and software. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method was used to study the expression ofgene in different developmental organs of broccoli. The sulforaphane contents of different developmental organs were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) method, and they were roots, stems, leaves, developmental buds at bolting stage (top buds, mature buds, buds one day before flowering and flowers), and seeds.analysis was carried out by the software SPSS 10.0.【Result】Full length sequence ofgenewere cloned, and the gene ofwas 2 014 bp in length, containing a 1 620 bp opening reading frame (ORF), encoded a polypeptide of 540 amino acids. They shared over 95% identity with the homologous proteins fromplants, such as cabbage, Chinese cabbage, Chinese kale and rapeThe bioinformatics analysis showed that the CYP79F1 protein was hydrophilic protein with two signal-peptides and two transmembrane regions, and the Wolf Psort protection indicated that they were located in the cytoplasm. The expression ofgene was higher in the roots and the stems, and the lowest in the leaves. During developmental stage of buds, the expression ofgenewas up-regulated in the early (young buds), and then decreased (mature buds to flowers). There was no difference significance in gene expression between roots, stems, leaves, developmental buds at bolting stage and seeds. Correlation analysis showed that the expression level ofgeneshowed an extremely significant positive correlation with sulforaphane content in developmental buds at bolting stage (=0.96，<0.05), and the expression ofgenemight influence the generation of sulforahane in different organs of broccoli, especially in developmental buds.【Conclusion】Thegenewere comprehensively obtained and characterized from broccoli,mayplay an important role in sulforaphane metabolism and revealing the diversity of sulforaphane content in different organs of broccoli.

broccoli; sulforaphane;;expression analysis; HPLC

2017-10-24；

2018-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372067，31501761）、國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23-A）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）

李占省，E-mail：lizhansheng@caas.cn。

劉玉梅，E-mail：liuyumei@caas.cn