紅殼色中華絨螯蟹群體遺傳特征的微衛(wèi)星分析

王正光，李曉東，姜玉聲*，左炳楠，司永國，鄭巖，劉谞，孫娜

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023; 2.盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心，遼寧 盤錦 124200)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、大閘蟹，隸屬于十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬(Eriocheir)，是中國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟蟹類[1]。但隨著大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，中華絨螯蟹的種質(zhì)出現(xiàn)明顯的退化[2-3]，開展良種選育工作勢在必行。遼寧省盤錦光合蟹業(yè)有限公司于2000年開始進行“光合1號”中華絨螯蟹的選育工作，2011年通過了國家級良種審定委員會審定[4]?！肮夂?號”是以北方水系中華絨螯蟹為基礎，以生長快、成活率高為目標的定向選育群體。該組研究人員在“光合1號”人工選育過程中，使用定向交配的方法，經(jīng)過4代近交篩選，建立了遺傳穩(wěn)定的紅殼色中華絨螯蟹家系[5]。

明確育種群體的遺傳特征是保證育種計劃順利實施的關鍵技術環(huán)節(jié)[6]。隨著紅殼中華絨螯蟹人工選育工作的廣泛開展，因此，有必要對其遺傳多樣性進行評估。用于魚類、貝類動物的體外標記識別育種群體譜系的方法并不適用于具有蛻殼習性的蝦蟹類，包括中華絨螯蟹，而分子標記技術可以有效地解決這一問題[7-8]。微衛(wèi)星(simple sequence repeat, SSR)作為第二代分子標記技術，具有符合孟德爾分離定律、多態(tài)性信息含量豐富、呈共顯性遺傳等特點，已廣泛應用于蟹類的遺傳分化分析[9-12]。本研究采用該技術對3個中華絨螯蟹群體進行遺傳多態(tài)性和群體間的遺傳分化分析，旨在明確各群體的遺傳距離，評估紅殼色中華絨螯蟹群體的遺傳特征，為其選育工作提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗蟹取自盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心基地，包括中華絨螯蟹紅殼色群體(HK)、紅殼色群體中正常殼色仔蟹(QK)以及“光合1號”育種群體(GH1)，每個群體雌、雄各20只，共取120只進行群體遺傳特征分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板制備

實驗蟹經(jīng)過冷凍麻醉，取其足部肌肉。采用常規(guī)酚/氯仿法提取基因組 DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 質(zhì)量，紫外分光光度法測定DNA 濃度和純度，無菌雙蒸水稀釋至 50 μg/mL后備用[13]。

1.2.2 PCR擴增與SSR引物篩選

參照原振政[14]應用的11對微衛(wèi)星引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公合成，引物序列及退火溫度如表1所示。

PCR擴增按照大連TaKaRa公司試劑盒方法操作，簡要介紹如下：PCR 反應體系為10 μL，其中包括10×buffer 1 μL，Mg2+(2.5 mmol/L)0.6 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.0 μL，正反向引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，Taq 酶 0.05 U，模板 1.0 μL，最后加 ddH2O補足體積至10 μL。擴增產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

PCR擴增產(chǎn)物先后通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢驗。制備 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，以15 W 恒定功率電泳 60～120 min。電泳結(jié)束后，取下凝膠放入AgNO3溶液中染色15 min，雙蒸水漂洗后放入顯色液(2% NaOH，8 mL 甲醛)中，待條帶充分顯現(xiàn)后分析電泳圖譜判定PCR擴增產(chǎn)物質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)每個樣品產(chǎn)生的條帶位置確定基因型，使用Popgen 32軟件(Bayer CropScience AG, Germany)分析各位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)-威納指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)與遺傳分化指數(shù)(Fst)，計算群體間的 Nei’s 遺傳距離[15]，并構(gòu)建UPGMA 系統(tǒng)樹[16]。采用固定指數(shù)(Fis)評估種群內(nèi)個體間的近交程度，同時計算Hardy-Weinberg 平衡偏離指數(shù)D，D=(Ho-He)/He公式。使用Cervus軟件(Field Genetics, Britain)計算引物的多態(tài)信息含量(PIC)[17]。

表1 中華絨螯蟹微衛(wèi)星分子標記及其引物序列Tab.1 Microsatellite markers and their primers sequences from E. sinensis

2 結(jié)果與分析

2.1 各基因位點的遺傳多態(tài)性

如表2所示，11對引物中的10對其多態(tài)信息含量PIC>0.5。3個中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性中，各群體的平均Ne在2.403 9～3.694 8之間，GH1、QK與HK群體的平均Ho分別為0.606 5、0.569 2、0.659 9，平均He分別為0.684 8、0.647 8、0.547 8，平均I分別為1.318 5，1.189 5，0.924 4，平均Fis分別為0.102 7、0.109 7、-0.220 8。其中GH1群體的平均He最高，HK群體的平均He最低，且與GH1群體差異顯著(P<0.05)。

3個群體的平均D在-0.110 9與0.712 7之間，在NE5、NE16、ES34這3個基因位點上均為負值，這表明3個群體在此3個基因位點上可能存在雜合子缺失。GH1群體的D在NE46與ESA67這兩個位點為正數(shù)，而在其余9個基因位點均為負數(shù)，由此推測，該群體存在嚴重的雜合子缺失現(xiàn)象。HK群體的平均D高于其他2個群體，但各群體之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 3個群體中華絨螯蟹在11個微衛(wèi)星位點上的遺傳多態(tài)性Tab.2 Genetic polymorphism of 11 pairs of microsatellite loci in 3 populations of E. sinensis

續(xù)表2，Tab.2 Continued

2.2 群體間的遺傳分化

Fst是用來評估種群內(nèi)部與種群之間遺傳分化的一個重要指標。當Fst<0.05時，群體間遺傳分化很小，可以不予考慮；當0.050.25，群體間高度分化[18]。本研究中GH1與QK群體之間Fst指數(shù)較小，為0.061 7，而HK群體與GH1、QK群體間Fst指數(shù)分別為0.113 3和0.104 1，3個群體之間均存在中度分化。由表3可知，HK與GH1群體之間遺傳距離與遺傳分化系數(shù)(Fst)最大(0.479 9/0.113 3)，遺傳相似系數(shù)最小(0.618 9);QK與GH1群體之間遺傳距離與Fst最小(0.277 8/0.061 7)，遺傳相似系數(shù)最大(0.757 5)?；贜ei’s遺傳距離構(gòu)建 UPGMA樹，獲得3個群體間的聚類分析結(jié)果。如圖2所示，GH1群體與QK群體聚為一支，HK群體單獨為一支。

表3 3個中華絨螯蟹群體的遺傳距離、遺傳分化指數(shù)與遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic distance, genetic differentiationand similarity degree of 3 populations of E. sinensis

注：“—”示無數(shù)據(jù)。對角線以下為遺傳距離/遺傳分化指數(shù)，對角線以上為相似性系數(shù)。

圖2 3個中華絨螯蟹群體的UPGMA樹Fig.2 UPGMA tree of 3 populations of E. sinensis

3 討論

3.1 群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生命進化和物種分化的基礎，在一定程度上決定了物種在自然或人為條件下對環(huán)境改變的適應能力[19]。本研究用11對微衛(wèi)星引物對中華絨螯蟹3個群體120只個體進行遺傳特征分析。根據(jù)Botstein等[20]提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，當PIC>0.5時該基因位點為高度多態(tài)性位點，0.25≤PIC<0.5時為中度多態(tài)性位點，PIC<0.25時為低度多態(tài)性位點。本研究選用的11對引物除ES34基因位點外，其余10對引物都有較高的多態(tài)信息含量(PIC>0.5)，表明所用引物的多態(tài)性符合群體遺傳分析要求。根據(jù)蘇龍等[21]的研究報道，當引物多態(tài)性含量較高時，10對引物可以準確分析實驗群體的遺傳結(jié)構(gòu)與聚類關系。本研究選擇了前期工作所使用的11對多態(tài)性良好的引物[14]，分析中華絨螯蟹3個人工選育群體的遺傳特性，如此不僅可以進行群體間的橫向分析，還可以進行選育群體多代的縱向比較。GH1與QK群體的平均PIC分別為0.623 0與0.579 8(PIC>0.5)，而HK群體的平均PIC為0.467 5(0.25≤PIC<0.5)，表明所用引物可以較高程度地評估前兩個群體的基因變異水平，中等程度評估后一群體的遺傳變異水平。相較于黃河、遼河和長江水系中華絨螯蟹野生群體[22-23]，本研究中3個群體的平均Ne、平均Ho與平均He均較低，這可能與多代的人工選育有關。長期人工定向交配選育有可能導致非目的性狀基因位點缺失，有效群體數(shù)量逐漸減少，群體遺傳變異水平下降，這也是很多經(jīng)濟種類在長時間、大規(guī)模養(yǎng)殖后其遺傳多樣性降低的主要原因[24]。羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippmarum)、日本對蝦(Penaeusjaponicus)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)與大菱鲆(Psettamaxima)等水產(chǎn)動物人工選育也出現(xiàn)過遺傳多樣性指數(shù)降低的現(xiàn)象[25-30]。人工選育雖然會導致遺傳多樣性降低，卻也利于選育群體基因的純化，保存有利性狀，使得育種性狀逐漸趨向穩(wěn)定。然而，選育群體遺傳多樣性若低于某一閾值，將會影響其對自然環(huán)境的適應能力[31]。因此，日后中華絨螯蟹選育應在保持選擇壓力獲得優(yōu)良性狀的同時，盡可能保持與目的性狀不相關基因位點的多樣性。另外，還可以通過增加親本數(shù)量降低近交的發(fā)生。

HK群體的平均Ne與He低于GH1群體，HK群體的平均I也低于GH1群體且差異顯著(P<0.05)，表明其遺傳多樣性低于GH1。這一結(jié)果不僅與多代的人工選育有關，也可能由于HK群體選育時間較短，其群體數(shù)量遠小于經(jīng)過長期選育的GH1群體。在封閉的小群體中，有效群體減少會增加遺傳漂變速度，并且遺傳漂變導致的遺傳多樣性丟失遠遠高于大群體[32]。HK群體具有小群體屬性，經(jīng)過人工定向選擇繁育，導致有效群體減少，最終使其遺傳漂變速度加快，遺傳多樣性丟失的概率提高。這種因親本數(shù)量較少導致的遺傳多樣性降低被稱為“始祖效應”，在大西洋鮭的養(yǎng)殖中也出現(xiàn)過類似現(xiàn)象[33]。而紅殼色群體中的正常殼色群體QK的遺傳多樣性要高于紅殼色群體HK，其原因可能與群體的遺傳漂變相關，或與本研究使用的微衛(wèi)星引物其自身特性有關，其中原因還需在未來的研究中進一步明確。

3.2 群體的雜合子的缺失現(xiàn)象

雜合子缺失可能與無效等位基因、基因分型誤差、性連鎖座位、取樣量較少和近交等原因相關[15, 34-35]。本研究中3個中華絨螯蟹群體在NE5、NE16、ES34基因位點上的D為負值，表明在這3個基因位點上出現(xiàn)了雜合子缺失。GH1群體的D僅在NE46與ESA67這兩個基因位點上為正數(shù)，在其余位點均為負數(shù)。蝦蟹類育種群體中雜合子缺失現(xiàn)象較為常見[36-38]，普遍認為其原因為：長期的人工定向選擇導致的基因純化，從而使某些基因位點選擇性消失，最終造成群體的遺傳多樣性下降。在今后的育種工作中，增加有效群體數(shù)量，提高雜合子比例，減少對自交個體的淘汰所導致的稀有等位基因缺失，以及由漂變所導致的雜合子缺失，將有助于防止中華絨螯蟹育種群體的種質(zhì)衰退。

3.3 紅殼色中華絨螯蟹群體的遺傳分化

梭子蟹科6種海產(chǎn)蟹的遺傳距離為0.200 0～0.939 4，紅星梭子蟹與日本蟳遺傳距離最大(0.939 4)[39]。本研究中HK群體最大遺傳距離為0.479 9，遠低于梭子蟹科野生種群，符合人工養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)特征。Fst指數(shù)分析顯示，HK群體較GH1、QK群體確實產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化?；贜ei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA樹顯示GH1與QK中華絨螯蟹群體之間的遺傳距離較小，與HK群體之間的遺傳距離較大。QK群體來源于紅殼色群體HK中正常殼色的個體，其親緣關系理應較近。然而，僅就體色性狀而言，GH1與QK群體并無差異。養(yǎng)殖過程中也發(fā)現(xiàn)兩者行為習性并無明顯差異，相對HK群體的遺傳背景，GH1與QK有可能更相似。另外，微衛(wèi)星引物和樣本的數(shù)量等特性也是影響遺傳分析的重要因素，增加其數(shù)量有助于精確實驗結(jié)果的分析。引物數(shù)量不同會影響遺傳距離的精確度，隨著引物數(shù)量增加，變異系數(shù)以及標準差呈下降趨勢，遺傳距離精確度會相應提升[40]。

固定指數(shù)Fis常用來表示群體內(nèi)個體間的近交系數(shù)。當群體內(nèi)Ho小于He，同時Fis為正值時，表明群體內(nèi)近交程度較嚴重；而Fis為負值，群體內(nèi)Ho大于He，則表示群體內(nèi)存在遠緣繁殖。據(jù)此可知，GH1與QK群體內(nèi)近交情況嚴重，而HK群體內(nèi)則存在著遠緣繁殖現(xiàn)象。雖然HK群體表現(xiàn)出一定的遠緣繁殖，但其遺傳多樣性卻較低，這可能仍然與其明顯分化的性狀所對應的特殊遺傳背景相關。李建林等[41]對鯉(Cyprinidae)6個群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析也發(fā)現(xiàn)，建鯉(CyprinuscarpiovarJian)Ho為0.705大于He的0.702，且Fis為-0.011，表明其群體內(nèi)存在明顯的遠緣繁殖，但其等位基因數(shù)與等位基因豐富度卻低于存在近交的黃河鯉(Cyprinuscarpio)群體，與本研究結(jié)果相似。日后在制定選育方案時，可加強GH1與QK群體的人為遠緣選育干擾，減少群體內(nèi)部近交。而HK群體可以作為新的育種家系，通過擴大選育群體數(shù)量，適當引入無消極影響的外源基因，增加其基因豐富度，進而提高群體的遺傳多樣性。

4 結(jié)論

3個中華絨螯蟹群體中，GH1群體遺傳多樣性最高，HK群體遺傳多樣性最低。各群體中3個微衛(wèi)星位點可能有雜合子缺失現(xiàn)象。HK群體與GH1、QK群體間產(chǎn)生了一定的遺傳分化。建議日后在GH1群體的人工選育中增加有效群體數(shù)量，降低近交發(fā)生概率。HK群體應在保證體色性狀穩(wěn)定的同時，擴大選育群體數(shù)量，適量引入非目的性狀相關基因位點，以增加其基因豐富度。

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