基于16S rRNA序列對4種扇貝4個群體親緣關(guān)系分析

相明玥，曾令坤，李禎，田瑩，常亞青，丁君

(農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023)

中國主要的養(yǎng)殖扇貝品種有海灣扇貝(Argopectenirradians)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)以及蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)。目前遼寧省大連市的市場上出現(xiàn)一種被稱作“俄羅斯櫛孔扇貝”的扇貝，該種扇貝與櫛孔扇貝在形態(tài)上極其相似，分類地位尚不明確。從養(yǎng)殖角度來說，此種扇貝極有經(jīng)濟價值[1]。但目前對該扇貝的研究主要集中在毒物學[2-3]、生態(tài)學[4-7]等方面，而在遺傳學及種質(zhì)資源方面少有報道。單純通過形態(tài)學觀察以及內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)鑒定不足以判定該品種與中國櫛孔扇貝的關(guān)系。因此，使用深層次的分子生物學技術(shù)是有效的解決辦法之一。

近年來，隨著分子生物學技術(shù)迅速發(fā)展，一系列新的分子學標記技術(shù)開始出現(xiàn)，如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)、DNA指紋技術(shù)等, 克服了以往用同功酶分析多態(tài)性位點比率偏低的缺陷。PCR技術(shù)和DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛使用，使得通過擴增確定基因序列成為可能。已選定的基因或基因片段在高度保守區(qū)域互補的通用引物下進行擴增，而后對PCR產(chǎn)物直接測序，分析比對序列數(shù)據(jù)，可明確基因序列。此技術(shù)在哺乳類[8-10]、魚類[11-12]等研究中廣泛應(yīng)用。本研究正是利用PCR擴增技術(shù)獲得“俄羅斯櫛孔扇貝”的16S rRNA核心片段序列，而后與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對。同時測定中國地區(qū)的櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝，以及美國大西洋地區(qū)的海灣扇貝和日本地區(qū)的蝦夷扇貝等不同地區(qū)扇貝線粒體16S rRNA 基因片段序列，與GenBank上已有的其他雙殼貝類的同源序列進行比對，分析這4種扇貝在不同分布區(qū)自然群體16S rRNA基因序列的多態(tài)性以及“俄羅斯櫛孔扇貝”在雙殼貝類中的遺傳地位，以期對其遺傳多樣性進行更深入的了解，并在分子水平上為研究分析不同地區(qū)的4種扇貝群體的遺傳背景提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的貝類樣品包括海灣扇貝(Argopectenirradians)、市場上俗稱的“俄羅斯櫛孔扇貝”(圖1)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)(圖2)全部取自大連智慧漁業(yè)集團有限公司(表1)。每個群體各取2枚鮮活個體，活體解剖取閉殼肌，立即放入無水乙醇中固定備用。其中，對“俄羅斯櫛孔扇貝”進行簡單的形態(tài)學測量(表2)。用游標卡尺(精確至0.01 mm)分別測量殼長、殼高、殼寬、絞合線長，用手術(shù)刀、剪、鑷等無菌解剖并分離軟體部、閉殼肌后分別使用電子天平(精確至0.01 g)稱量體質(zhì)量、軟體部質(zhì)量和閉殼肌質(zhì)量。

表1 實驗材料信息Tab.1 The information of materials in this study

表2 “俄羅斯櫛孔扇貝”形態(tài)學特征Tab.2 The measureable characters of Russia Chlamys farreri

圖1 “俄羅斯櫛孔扇貝”的右殼(A)和左殼(B)Fig.1 The right shell (A) and the left shell (B) of Russian Chlamys farreri

圖2 櫛孔扇貝的右殼(A)和左殼(B)Fig.2 The right shell (A) and the left shell(B) of Chlamys farreri

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取和含量檢測

參考DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司http://www.tiangen.com/)提取扇貝的基因組DNA, 用紫外分光光度計(NV3000,美國斯威特)測定其濃度和純度, 并用8.0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測, 之后用ddH2O稀釋DNA至50 ng/μL, -20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rRNA基因的擴增及序列測定

利用通用引物16SF(5′-CGCCTGTTTAA CAAAAACAT-3′)16SR(5′-CCGGTTTGAACTCAGA TCACGT-3′)[13]進行常規(guī)PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如下：DNA模板(50 ng/μL) 1.0 μL，引物16SF(10 μmol/L) 1.0 μL，引物16SR(10 μmol/L) 1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，10×bufer 2.0 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.0 μL，Taq(5 U/μL) 0.1 μL，無菌超純水補足至20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，如此進行35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物7 μL與2 μL的6×loading buffer混勻，在20 g/L瓊脂糖凝膠(含1.7 μL溴酚藍)上電泳(電壓為95 V)，直至溴酚藍移動到距離膠板下沿約1 cm處時，停止電泳。用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，初步檢測PCR產(chǎn)物。每個扇貝群體選取2枚個體的PCR產(chǎn)物，按照BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒方法，經(jīng)DNA 測序儀(ABI3730xl DNA Analyzer，美國Perkin Elmer)，獲得DNA雙向序列，而后對序列和峰圖進行人工校對。

1.2.3 序列分析

測得序列用BioEdit(Version 7.2.6, Carlsbad, USA)軟件去掉序列兩端不可信部分，通過Clustal X(Version 1.83, Conway Institute UCD Dublin, Ireland)軟件進行多序列對比和分析，Clustal格式對比文件采用MEGA 5.0(Center for Evolutionary Medicine and Informatics，The Biodesign Institute，USA)軟件分析序列的堿基組成以及它們的遺傳距離，按照Kimura雙參數(shù)法計算物種間的DNA序列差異及種間遺傳距離。結(jié)合GenBank中其他雙殼貝類(長牡蠣為外群)16S rRNA同源序列(表3)，采用鄰接法Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度采用重抽樣法(boot-strap)，通過1 000次循環(huán)評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 DNA模板及擴增產(chǎn)物的檢測

DNA模板瓊脂糖電泳結(jié)果顯示(圖3)，DNA條帶完整、清晰、無雜帶，可用于后續(xù)實驗。PCR擴增的片段位于500～750 bp。

表3 用于系統(tǒng)分析的扇貝物種及其16S rRNA GenBank注冊號Tab.3 Species used for the phylogenetic analysis andGenBank accession number

注：*表示本實驗所重點比較的序列。

圖3 4種扇貝16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物 1、2號DNA條帶為中國地區(qū)蝦夷扇貝16S rRNA基因片段， 3、4號條帶為中國地區(qū)櫛孔扇貝，5號條帶為中國地區(qū)海灣扇貝， 6號條帶為俄羅斯櫛孔扇貝，7號條帶為日本地區(qū)蝦夷扇貝， 8、9號條帶為美國大西洋地區(qū)海灣扇貝。Fig.3 The sequence was amplified via polymerase chain reaction of the 4 species scallops of 16S rRNA gene No.1 and No.2 are the 16S rRNA partial gene sequence of Chinese Patinopecten yessoensis. No.3 and No.4 are the 16S rRNA partial gene sequence of Chinese Chlamys farreri. No.5 is Chinese Argopecten irradians. No.6 is Russian chlamys farreri. No.7 is Japan Patinopecten yessoensis. No.8 and No.9 are the 16S rRNA partial gene sequence of American Argopecten irradians.

2.2 序列特性和堿基組成

將所測得的4種扇貝的16S rRNA序列經(jīng)BioEdit軟件處理，去掉不可信位點后，得到607 bp的基因片段。應(yīng)用MEGA 5.0計算出6條序列的A、T、G、C的含量(表4)，4種扇貝的A+T的含量為52.0%～55.0%，平均為53.5%；而G+C的含量為45.0%～48.0%，平均為46.4%。A+T的含量高于G+C含量。

應(yīng)用MEGA 5.0軟件對序列進行分析，得到555 bp的基因片段?！岸砹_斯櫛孔扇貝”與中國的櫛孔扇貝序列對比中，保守位點521個，變異位點74個，轉(zhuǎn)換位點43個，顛換位點31個；與美國大西洋的海灣扇貝序列比對中，保守位點450個，變異位點106個，轉(zhuǎn)換位點69個，顛換位點37個；與中國的海灣扇貝序列對比中，保守位點405個，變異位點100個，轉(zhuǎn)換位點59個，顛換位點41個；與日本的蝦夷扇貝序列比對，保守位點527個，變異位點61個，轉(zhuǎn)換位點35個，顛換位點26個；與中國的蝦夷扇貝序列比對中，保守位點531個，變異位點58個，轉(zhuǎn)換位點34個，顛換位點24個。

表4 4種扇貝堿基含量Tab.4 Base content of 4 kinds of scallop %

2.3 4種扇貝屬物種分化比較

通過計算4種扇貝屬物種遺傳距離可知(表5)：“俄羅斯櫛孔扇貝”與中國蝦夷扇貝遺傳距離最近(0.073)；與中國海灣扇貝遺傳距離最遠(0.221)；與櫛孔扇貝遺傳距離為0.082。物種之間遺傳距離平均值為0.154。

表5 4種扇貝屬物種遺傳距離Tab.5 Genetic distance of 4 species of scallop

注：“—”示無數(shù)據(jù)。

2.4 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于扇貝16S rRNA基因序列，用MEGA 5.0軟件按照Kimura雙參數(shù)進行1 000次重復(fù)抽樣分析，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，7種扇貝科貝類聚在一起，長牡蠣分為獨立的一支，島扇貝(俄羅斯櫛孔扇貝)和蝦夷扇貝聚為1支，然后又與櫛孔扇貝聚為1支。表現(xiàn)為同種扇貝之間遺傳距離最近，且置信度100%。

圖4 應(yīng)用MEGA 5.0軟件中鄰接法(NJ)構(gòu)建基于16S rRNA序列的8種雙殼貝類的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of 8 species of bivalve based on the 16S rRNA gene by using MEGA 5.0

3 討論

3.1 扇貝16S rRNA基因片段堿基序列分析

近年來，16S rRNA已經(jīng)逐漸應(yīng)用于海洋生物屬間[14-15]、種間的分子系統(tǒng)學和種質(zhì)鑒定[16]方面的研究，在海洋雙殼貝類的分子系統(tǒng)學研究及種群關(guān)系的分析方面也有報道，但它在貝類中的分化速度及變異程度有所不同。鑒于研究結(jié)果的不同，一般認為，線粒體16S rRNA基因序列分析適用于種尤其是屬及屬以上階元的分類[17]。本研究中涉及的“俄羅斯櫛孔扇貝”與中國廣泛養(yǎng)殖的3種養(yǎng)殖扇貝之間的分類階元均在屬以上，進行16S rRNA序列的比對分析能夠有效地揭示這4種扇貝之間的親緣關(guān)系，更加明確“俄羅斯櫛孔扇貝”的分類地位。

本研究被檢測的樣品中，4種堿基(A、T、G、C)各自的含量較為接近，而且這幾種扇貝的基因片段中，A+T的含量高于G+C的含量，這個結(jié)果與其他研究者在頭足類[18-19]、雙殼類[20-21]、甲殼類[22]等的16S rRNA對比結(jié)果一致。即較高的A+T量是目前觀測到的無脊椎動物線粒體DNA序列中普遍存在的現(xiàn)象[17]。

將PCR擴增技術(shù)擴增出的“俄羅斯櫛孔扇貝”16S rRNA核心片段序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對。結(jié)果表明：數(shù)據(jù)庫中序列同源性為100%，確定市場上出現(xiàn)的“俄羅斯櫛孔扇貝”其學名為島扇貝(Chlamysislandica)，多分布于極地附近。結(jié)合GenBank上其他雙殼貝類的同源序列，對其序列變異和系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析，結(jié)果顯示，與島扇貝親緣關(guān)系由近及遠分別蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、赭類櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海扇貝、海灣扇貝及長牡蠣。島扇貝與蝦夷扇貝同屬于一個分支。種間與種內(nèi)序列的差異分析顯示，16S種內(nèi)遺傳距離在0.000到0.008之間，平均為0.001；種間的遺傳距離在0.053到0.309之間，平均為0.231[23]。即與櫛孔扇貝(0.082)相比，二者已達到種間差異水平；島扇貝與蝦夷扇貝遺傳距離更小，親緣關(guān)系較近(0.073)；島扇貝與海灣扇貝親緣關(guān)系較遠(0.221)。系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)測繪結(jié)果與核苷酸變異值分析結(jié)果一致，這一結(jié)果將為在分子水平上研究不同地區(qū)的這4種扇貝遺傳背景提供基礎(chǔ)理論。

3.2 16S rRNA基因序列于雙殼貝類種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

利用16S rRNA基因序列對雙殼貝類系統(tǒng)發(fā)育的研究已有報道。Boulding等[20]用此法分析了蝦夷扇貝一個養(yǎng)殖群體和兩個野生群體樣品，發(fā)現(xiàn)了豐富的遺傳變異；Saavedra等[24]通過線粒體16S與12S基因序列分析研究了美國多種雙殼貝類的系統(tǒng)進化關(guān)系；李霞等[17]通過對海扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝16S rRNA同源序列的對比發(fā)現(xiàn)，它們分別存在3、7、8、13個差異位點，核苷酸變異位點較為豐富，且堿基顛換和插入變異比例大于堿基轉(zhuǎn)換；胡麗萍等[25]利用16S rRNA序列探討紫扇貝(Argopectenpurpuratus)在海灣扇貝屬中的分類地位，發(fā)現(xiàn)紫扇貝和海灣扇貝同源序列間的變異均來自轉(zhuǎn)換或者顛換，無插入或缺失變異，且轉(zhuǎn)換位點多于顛換位點，這些變異位點可用于分子系統(tǒng)學和遺傳學的分析。目前，對于島扇貝的研究在遺傳學及種質(zhì)資源方面鮮有報道，單純的通過形態(tài)學以及簡單的內(nèi)部解剖構(gòu)造觀察不足以將該品種與中國櫛孔扇貝進行區(qū)分。本研究中利用16S rRNA基因序列，得出了島扇貝與中國廣泛養(yǎng)殖的3種扇貝之間親緣關(guān)系并確定了其分類地位，這一結(jié)果為扇貝的種質(zhì)鑒定工作進行了有效的補充。

4 結(jié)論

本研究基于16S rRNA基因片段，利用PCR擴增及測序技術(shù)，將人們俗稱的“俄羅斯櫛孔扇貝”與櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝進行比對，并結(jié)合GenBank中其他雙殼貝類16S rRNA序列計算種間遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確探討該扇貝的分類地位。結(jié)果表明：該“俄羅斯櫛孔扇貝”是島扇貝(Chlamysislandica)，與該扇貝親緣關(guān)系由近及遠分別是蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、赭類櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海扇貝、海灣扇貝和長牡蠣。島扇貝與蝦夷扇貝遺傳距離最近。種內(nèi)與種間的差異分析顯示，島扇貝與櫛孔扇貝遺傳距離已達到種間差異水平。本研究為在分子水平上研究了不同地區(qū)的4種扇貝群體遺傳背景提供信息。

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