犬高頻起搏誘發(fā)心房顫動(dòng)模型心房電活動(dòng)及神經(jīng)重構(gòu)機(jī)制研究*

胡嘉祿 唐敏娜 張峰 敖登 雷芾華

心房的電重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)在觸發(fā)和維持心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。目前國(guó)內(nèi)外制作自主神經(jīng)介導(dǎo)AF的模型，均是用400～500次/分(bpm)頻率起搏心房，并同步刺激心臟自主神經(jīng)[4-5]。以此方法制作的自主神經(jīng)介導(dǎo)AF的動(dòng)物模型，同時(shí)有心房肌的神經(jīng)重構(gòu)和電重構(gòu)，因此無法單獨(dú)解釋神經(jīng)重構(gòu)介導(dǎo)的AF發(fā)生機(jī)制。已有基礎(chǔ)和臨床研究研究報(bào)道，以1 200 bpm頻率起搏右房，因起搏頻率短于心房不應(yīng)期而不能奪獲心房，故而可以單獨(dú)刺激心房?jī)?nèi)神經(jīng)叢，制作心臟自主神經(jīng)單因素誘導(dǎo)的AF模型[6]。筆者通過比較500 bpm和1 000 bpm頻率起搏高位右房、刺激右位迷走神經(jīng)干(RVNT)對(duì)AF的誘發(fā)和維持，以及對(duì)心房肌電重構(gòu)及神經(jīng)重構(gòu)的影響，闡明1 000 bpm頻率起搏高位右房在制作心臟自主神經(jīng)介導(dǎo)AF模型中的作用，以及指導(dǎo)臨床干預(yù)自主神經(jīng)治療AF的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和麻醉 動(dòng)物中心提供健康成年比格犬48條，雌雄不限，體重15～20 kg，隨機(jī)平均分為6組，每組8只。A組：對(duì)照組，以105%基礎(chǔ)心率頻率起搏高位右房(奪獲心房)；B組：以500 bpm頻率起搏高位右房；C組：以1 000 bpm頻率起搏高位右房；D組：刺激RVNT；E組：以500 bpm頻率起搏高位右房+刺激RVNT，F(xiàn)組：以1 000 bpm頻率起搏高位右房+刺激RVNT。術(shù)前采用超聲心動(dòng)圖，排除瓣膜型心臟病和先天性心肌病等器質(zhì)性心臟病。研究方案經(jīng)過動(dòng)物倫理審查(IACUC-20170325009)。術(shù)前12 h禁食,6 h禁飲,氯胺酮(20 mg/kg)基礎(chǔ)麻醉，3%戊巴比妥鈉泵維持麻醉。備皮、固定、氣管插管和輔助呼吸，氧流量4～6 L /min、潮氣量10 ml /kg。Lead7000電生理儀(四川錦江電子科技有限公司)Ⅱ?qū)?lián)記錄和監(jiān)測(cè)體表心電圖,監(jiān)測(cè)生命體征。

1.2高位右房起搏和心電活動(dòng)記錄 分離右側(cè)頸外靜脈，經(jīng)右側(cè)頸外靜脈置4極電極導(dǎo)管于高位右房，記錄高位右房?jī)?nèi)心電圖。取臥位,沿左側(cè)第四肋間開胸,切開心包暴露心臟。分別將4極導(dǎo)管縫在左上肺靜脈、左下肺靜脈和左心耳，記錄清晰的局部的心內(nèi)膜電位，關(guān)閉胸腔。使用 DF-3A 型電生理刺激儀(蘇州中國(guó)東方電子儀器廠)，以105%基礎(chǔ)心率、500 bpm和1 000 bpm的刺激頻率，2倍舒張期閾值電壓，2 ms脈寬，S1S1模式持續(xù)起搏高位右房12 h，并記錄體表心電圖。

1.3AF誘發(fā)率和AF持續(xù)時(shí)間測(cè)定 AF誘發(fā)方法：起搏后每2 h，使用電生理刺激儀，以300 ms Burst刺激高位右房30 s，重復(fù)刺激誘發(fā)5次，記錄AF的誘發(fā)次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。AF定義為心房無序的電活動(dòng),心電圖表現(xiàn)為P波消失,代之以大小不等、間隔不均、形態(tài)不一的f波,頻率450～600次/分,RR間期不等,持續(xù)5 s以上，自發(fā)或誘發(fā)出的AF持續(xù)時(shí)間≥5 min為持續(xù)性AF。AF誘發(fā)率=成功誘發(fā)次數(shù)/總誘發(fā)次數(shù)，AF持續(xù)時(shí)間=總AF持續(xù)時(shí)間/AF誘發(fā)次數(shù)。

1.4心內(nèi)電生理指標(biāo)測(cè)定 ①有效不應(yīng)期(ERP)測(cè)定：高位右房起搏后，每2 h測(cè)定右房的ERP。ERP測(cè)定：S1S2以300 ms/280 ms開始，以步長(zhǎng)5 ms遞減，直至不能奪獲心房的最長(zhǎng)S1S2間期，測(cè)量3次ERP取其均值。

②ERP離散度(ERPd)計(jì)算：本研究取各時(shí)間點(diǎn)左右心房的ERP最大值減去最小值代表ERPd。

1.5心率變異性(HRV)測(cè)定 電生理儀監(jiān)測(cè)體表心電圖(ECG),每次待心電信號(hào)穩(wěn)定后，使用LabChart7軟件，記錄起搏后每2 h的ECG。每次分析0.5 h內(nèi)的HRV的高頻(HF)與低頻(LF)成分之比(HF/LF)。

1.6神經(jīng)刺激及神經(jīng)信號(hào)記錄 右側(cè)頸部切開皮膚，分離犬RVNT并置入雙極針狀電極，并用自制神經(jīng)信號(hào)記錄電極采集迷走神經(jīng)干信號(hào),固定電極并縫合皮膚。鎖骨上窩切開皮膚，逐層分離暴露星狀神經(jīng)節(jié)(SG)，并固定自制神經(jīng)信號(hào)記錄電極于SG，縫合皮膚。連接雙極針狀電極于Grass刺激儀上(贊德儀器有限公司) ，以1～8 V電壓, 20 Hz頻率, 0.05～0.1ms脈寬，刺激RVNT至心率顯著降低50%基礎(chǔ)心率。神經(jīng)信號(hào)記錄電極連接Powerlab電生理記錄儀(AD Instruments公司)， 采集并記錄神經(jīng)放電信號(hào)。采用LabChart Pro專業(yè)版數(shù)據(jù)采集分析軟件，分析起搏前后每2 h的SG和RVNT的放電信號(hào)幅度、信號(hào)面積和放電時(shí)程，每小時(shí)任取300 s神經(jīng)信號(hào)圖形做分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1AF誘發(fā)率及AF持續(xù)時(shí)間 48條犬均完成實(shí)驗(yàn)。高位右房起搏2～6 h，各組AF誘發(fā)率，隨著起搏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)，起搏8 h后，AF的誘發(fā)率將不再顯著增加(P>0.05)。與A組比較，B、D組各時(shí)間點(diǎn)AF誘發(fā)率顯著增加。與B組比較，C、E組AF誘發(fā)率顯著增加。與C組比較，F(xiàn) 組的AF誘發(fā)率顯著降低(表1)。

各組AF維持時(shí)間，隨著起搏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，B組的AF維持時(shí)間增加，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與A和B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，C組的AF維持時(shí)間顯著增加(P>0.05)。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，D組的AF維持時(shí)間顯著增加(P>0.05)。與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，E組的AF維持時(shí)間顯著增加(P>0.05)。與C組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,F組的AF維持時(shí)間顯著減少(P>0.05)(表2)。500 bpm起搏高位右房，右房心內(nèi)電激動(dòng)表現(xiàn)為顫動(dòng)傳導(dǎo)，而左房心內(nèi)膜電激動(dòng)表現(xiàn)為規(guī)整的心房傳導(dǎo)。1 000 bpm起搏高位右房，左右心房的心內(nèi)電激動(dòng)均為激動(dòng)顫動(dòng)傳導(dǎo)(圖1)。

表1 起搏不同時(shí)間右房AF誘發(fā)率/%(n=40)

注：與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,*和▲P<0.05。與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，※※和▲▲P<0.05。與C組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05

表2 起搏不同時(shí)間右房AF維持時(shí)間/min(n=40)

注：與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,*和▲P<0.05。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，※※P<0.05。與C組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05

2.2心房肌ERP及ERPd改變 高位右房起搏2～6 h后，各組的AERP均顯著縮短，8 h縮短達(dá)到高峰(P<0.05)。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，B組的ERP縮短程度顯著增加P<0.001。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，C組的ERP縮短程度顯著增加,但與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，ERP縮短程度顯著顯小。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，D組的ERP縮短程度顯著增加P<0.05。與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，E組的ERP縮短程度顯著增加P<0.001(表3)。

高位右房起搏，右心房ERPd均出現(xiàn)顯著變化，與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，B、C、D、E和F和的ERPd顯著增加，但B組和E組的ERPd顯著大于其它各組(P<0.001)(表4)。

2.3神經(jīng)信號(hào)變化 各組在各觀察時(shí)間點(diǎn)，均有神經(jīng)信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化。A組的RVNT神經(jīng)放電幅值大于SG。B組的RVNT和SG神經(jīng)放電幅值同等，與基礎(chǔ)對(duì)照，沒有顯著增加。C組的SG神經(jīng)放電幅值顯著增加，RVNT神經(jīng)放電幅值顯著減小。D組的RVNT和SG放電時(shí)程等同減少，RVNT神經(jīng)放電幅值強(qiáng)于SG放電幅值。與B組比較，E組的RVNT和SG神經(jīng)放電幅值等同減少，但放電時(shí)程顯著增加。與C組比較,F組的SG放電幅值顯著減小，RVNT神經(jīng)放電幅值增加(圖2)。

A圖：500 bpm高右房起搏誘發(fā)AF，高右房1,2電極(HRA1-2)顯示心房顫動(dòng)傳導(dǎo)，左心耳1,2電極(LAA1-2)和左下肺靜脈1,2電極(LIPV1-2)顯示心房規(guī)則的房性心動(dòng)過速傳導(dǎo)和房-室(A-V)1∶1傳導(dǎo)。B圖：1 000 bpm右房起搏誘發(fā)AF，LAA1-2和LIPV1-2，顯示心房顫動(dòng)傳導(dǎo)

2.4HRV的HF/LF變化 起搏12 h后，與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，B組的HF/LF值無顯著變化。與A、B組比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，C組的HF/LF值顯著減小(P<0.05)。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，D組的HF/LF值顯著增加(P<0.05)。與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，E組的HF/LF值顯著增加(P<0.05)。與C組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，F(xiàn)組的HF/LF值增加(P>0.05)(表5)。

3 討論

為探究AF發(fā)生發(fā)展的電重構(gòu)和神經(jīng)重構(gòu)機(jī)制，建立符合臨床AF病因與發(fā)病機(jī)制的模型至關(guān)重要[1]，AF模型的臨床疾病代表性是目前關(guān)注的重點(diǎn)。

快速起搏心房制作動(dòng)物AF模型已有近50年的歷史，400～600 bpm頻率起搏是當(dāng)今多數(shù)研究中心采用的制作心房肌“電重構(gòu)”改變?yōu)橹鞯腁F模型的方法。起搏心房并同步電刺激RVNT、心臟神經(jīng)叢、SG和腎交感神經(jīng)等，或施以干預(yù)自主神經(jīng)的藥物如阿托品和去甲腎上腺素等，能夠?qū)F模型的誘發(fā)率從20%提高到89%，也是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外制作自主神經(jīng)介導(dǎo)AF模型共識(shí)的方法[6-8]，然而該模型因同步起搏心房和電刺激神經(jīng)，產(chǎn)生了心房肌的神經(jīng)和電重構(gòu)共存改變，無法解釋神經(jīng)重構(gòu)單一因素介導(dǎo)AF的發(fā)生機(jī)制。

表3 起搏不同時(shí)間右房ERP縮短程度/%(n=8)

注：與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,*P<0.05;※※P<0.05。與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，▲P<0.05。與B組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，▲▲P<0.001

表4 起搏不同時(shí)間右房ERPd變化/ms(n=8)

注：與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,※P<0.001;※※P<0.05;▲P<0.05;▲▲P<0.001;△P<0.05

本研究觀察了犬500 bpm和1 000 bpm起搏高位右房、刺激RVNT、500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT和1 000 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，干預(yù)12 h，右房的AF誘發(fā)率和維持時(shí)間、AERP、AERPd、HF/LF、RVNT和SG的神經(jīng)信號(hào)變化。筆者發(fā)現(xiàn)：500 bpm起搏高位右房，主要產(chǎn)生心房肌的電重構(gòu)改變。1 000 bpm起搏高位右房，心房肌產(chǎn)生以交感神經(jīng)重構(gòu)為主的改變。RVNT產(chǎn)生迷走神經(jīng)重構(gòu)為主的改變。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，產(chǎn)生迷走神經(jīng)重構(gòu)合并電重構(gòu)為主的改變。

A組：RVNT(藍(lán)色)神經(jīng)放電幅值大于SG(紅色)。與A組比較，B組的SG和RVNT神經(jīng)放電幅值沒有顯著增加；C組的SG神經(jīng)放電幅值顯著增加，RVNT神經(jīng)放電幅值顯著減??；D組的RVNT神經(jīng)放電幅值顯著增加，SG放電幅值顯著減小；E組的RVNT和SG放電幅值等同減少，RVNT放電幅值大于SG放電幅值，但放電時(shí)程顯著增加。與C組比較，F(xiàn)組SG放電幅值顯著減小，RVNT神經(jīng)放電幅值增加

筆者提出以500 bpm起搏高位右房，1 000 bpm起搏高位右房，刺激RVNT或500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，分別可以制作出心房電重構(gòu)、交感神經(jīng)重構(gòu)、迷走神經(jīng)重構(gòu)以及迷走神經(jīng)重構(gòu)合并心房電重構(gòu)的AF模型。

3.1500 bpm起搏高位右房誘發(fā)AF 本研究發(fā)現(xiàn)，500 bpm起搏高位右房，右房出現(xiàn)了不規(guī)則的顫動(dòng)傳導(dǎo)，而左房仍然是規(guī)律的激動(dòng)傳導(dǎo)，這種左右房間的電激動(dòng)的傳導(dǎo)差異，造成了心房AERPd顯著增大。Allessie等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，400 bpm起搏左房誘發(fā)AF，左右心房的AERP縮短不顯著，但AERPd顯著增大，認(rèn)為決定AF易感性的因素是AERPd，而非AERP縮短。筆者的研究還發(fā)現(xiàn)，500 bpm起搏高位右房誘發(fā)AF,HF/LF比值和SG及RVNT神經(jīng)活動(dòng)變化不顯著，提示500 bpm起搏高位右房誘發(fā)AF時(shí)，心房肌出現(xiàn)AERPd顯著增大的電重構(gòu)改變，而無顯著的神經(jīng)重構(gòu)。 因此筆者認(rèn)為，500 bpm起搏犬高位右房，可以制作電重構(gòu)AF模型，用以研究AF的電重構(gòu)機(jī)制，也提示在臨床心房肌平均顫動(dòng)頻率較低的AF患者，難以從增加干預(yù)心臟自主神經(jīng)治療策略獲益。

3.2刺激RVNT誘發(fā)AF 本研究發(fā)現(xiàn)，單純刺激RVNT，能夠誘發(fā)18%～25%的AF發(fā)生，500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，AF的誘發(fā)率顯著增加到58%～80%。刺激RVNT誘發(fā)AF時(shí)，心房肌的ERP和ERPd的電重構(gòu)改變不顯著。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT誘發(fā)AF時(shí)，心房肌出現(xiàn)顯著的ERP縮短和ERPd增大的電重構(gòu)改變。1955年Hoff等[10]用起搏心房并刺激膽堿能神經(jīng)纖維或心臟灌流乙酰膽堿，制作了“迷走神經(jīng)介導(dǎo)的AF”模型。認(rèn)為刺激迷走神經(jīng)，增加了心房AERP的縮短、AERPd 增加和電傳導(dǎo)異常。本研究進(jìn)一步觀察到，刺激RVNT和500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，HF/LF比值顯著增大，RVNT的神經(jīng)活動(dòng)顯著增加，提示出現(xiàn)了顯著的迷走神經(jīng)重構(gòu)的改變。筆者認(rèn)為，刺激RVNT，可以制作“迷走神經(jīng)觸發(fā)AF”的動(dòng)物模型，用于研究“迷走神經(jīng)重構(gòu)AF”的機(jī)制。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，可以制作“迷走神經(jīng)介導(dǎo)AF”模型，用于研究“迷走神經(jīng)重構(gòu)并心房肌電重構(gòu)AF”機(jī)制研究。提示臨床上“迷走神經(jīng)觸發(fā)AF”，干預(yù)迷走神經(jīng)，可以獲得最佳治療效益?！懊宰呱窠?jīng)介導(dǎo)AF”，肺靜脈電隔離消融術(shù)+迷走神經(jīng)消融策略，有可能獲益更多。

表5 起搏不同時(shí)間HRV(HF/LF)比值變化(n=8)

注：與A組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,※、▲、△P均<0.05

3.31 000 bpm起搏高位右房誘發(fā)AF Schauerte等[11]研究表明：高頻電刺激肺靜脈神經(jīng)節(jié)叢,可以引發(fā)肺靜脈局部電活動(dòng)增強(qiáng),從而有利于AF誘發(fā)。Scherlag等[12]研究顯示：刺激含有神經(jīng)節(jié)叢的心外膜脂肪墊，能在房性早搏刺激的基礎(chǔ)上誘發(fā)AF。近來有研究報(bào)道，以1 200 bpm短于心房肌不應(yīng)期的快頻率起搏右房，因刺激不能奪獲心房肌，可以獲得刺激心房?jī)?nèi)的自主神經(jīng)的效應(yīng)，易化AF的誘發(fā)，可以制作心房肌重構(gòu)AF模型[6，13]，然而對(duì)其制作AF模型的可靠性、確切的神經(jīng)電生理機(jī)制，尚無研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，1 000 bpm起搏高位右房,AF的誘發(fā)率在57%～79%，AF的維持時(shí)間在5～30 min，顯著高于500 bpm起搏高位右房。1 000 bpm起搏高位右房，心房肌的ERP和ERPd變化不顯著，但HF/LF比值顯著降低，SG神經(jīng)活動(dòng)信號(hào)明顯增強(qiáng)。1 000 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，顯著降低1 000 bpm起搏高位右房的AF誘發(fā)率和維持時(shí)間，顯著逆轉(zhuǎn)了1 000 bpm起搏高位右房HF/LF比值的降低和SG神經(jīng)活動(dòng)信號(hào)的增強(qiáng)。提示1 000 bpm起搏高位右房誘發(fā)AF時(shí)，心臟交感神經(jīng)發(fā)生了顯著的重構(gòu)，增加刺激RVNT,抵消了交感活動(dòng)的增加。本研究表明，1 000 bpm起搏高位右房，可以制作“交感神經(jīng)張力異常AF”的模型，用于AF交感神經(jīng)重構(gòu)機(jī)制的研究。提示在臨床心房肌顫動(dòng)頻率較高的AF患者，可以獲益于干預(yù)心臟交感神經(jīng)治療。

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