糖尿病大鼠髕腱來(lái)源肌腱干細(xì)胞體外成脂分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究

徐宏亮，石柳，李滎娟，徐林，王宸,3,4，陳輝,3,4，芮云峰,3,4

(1.無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院 骨科，江蘇 無(wú)錫 214000； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院無(wú)錫分院 骨科，江蘇 無(wú)錫 214000； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009； 4.東南大學(xué)創(chuàng)傷骨科研究所，江蘇 南京 210009； 5.香港中文大學(xué) 矯形外科及創(chuàng)傷學(xué)系，香港； 6.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 老年科，江蘇 南京 210009)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)作為機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病，除了本身高血糖特征以外，還會(huì)導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生[1]。目前越來(lái)越多的研究證實(shí)，持續(xù)的高血糖也會(huì)導(dǎo)致骨骼肌肉系統(tǒng)發(fā)生病變，而肌腱作為骨骼肌肉系統(tǒng)的重要組成，DM對(duì)其的影響尚未被深入研究。前期我們通過(guò)文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)，DM肌腱的組織學(xué)形態(tài)發(fā)生病理改變以及生物力學(xué)特性較正常肌腱降低，而在細(xì)胞與分子生物學(xué)水平的變化還有待進(jìn)一步研究[2]。我們研究發(fā)現(xiàn)，肌腱組織中存在的一群具有多向分化潛能的肌腱干細(xì)胞(tendon derived stem cells, TDSCs)，在維持肌腱穩(wěn)態(tài)以及損傷修復(fù)過(guò)程中起到重要的作用[3]。成脂分化潛能為干細(xì)胞的分化特性之一，而DM對(duì)TDSCs成脂分化潛能的影響尚未闡明。本研究我們通過(guò)構(gòu)建DM SD大鼠模型，探究DM大鼠髕腱來(lái)源TDSCs的體外成脂分化潛能變化，以探討DM對(duì)TDSCs成脂分化特性的影響，為進(jìn)一步研究其分子生物學(xué)機(jī)制提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料和儀器

1.1.1 動(dòng)物 健康雌性成年SD大鼠(8周齡，200～250 g，SPF級(jí))6只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)期間SD大鼠在東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在東南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.1.2 材料和儀器 羅氏血糖儀、血糖試紙和Ⅰ型膠原酶均為德國(guó)羅氏診斷公司(Roche Diagnostics GmbH)產(chǎn)品；LG-DMEM、體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；鏈脲佐菌素(STZ)、維生素C、地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤、吲哚美辛、胰島素、油紅O染液為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒和PCR引物為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；First-Strand cDNA試劑盒為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 建立DM大鼠模型 通過(guò)腹腔注射STZ溶液建立1型DM大鼠動(dòng)物模型的方法已經(jīng)在DM的實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛的應(yīng)用[4-5]。將SD大鼠隨機(jī)分為DM組和對(duì)照組各3只。將STZ溶解于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.6)中，配置成10 mg·ml-1的STZ-檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，并通過(guò)0.22 μm濾菌器去除細(xì)菌。DM組和對(duì)照組分別腹腔注射STZ-檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(65 mg·kg-1)和等體積的檸檬酸鹽緩沖液(對(duì)照組)。造模3 d后測(cè)量并記錄大鼠血糖(每3 d 1次)，DM組大鼠以血糖值持續(xù)高于250 mg·dl-1為造模成功。

1.2.2 大鼠TDSCs的分離培養(yǎng) 我們?cè)谥暗膶?shí)驗(yàn)中已經(jīng)建立了大鼠TDSCs的提取及培養(yǎng)方法[3,6]。在造模成功后兩周，通過(guò)斷頸法處死大鼠并測(cè)量體重，將大鼠浸泡于75%酒精中5 min，在無(wú)菌條件下取出髕腱，小心去除髕腱的肌腱-骨移行部分以及肌腱表面的腱膜后將其放入無(wú)菌的PBS緩沖液中。通過(guò)滅菌的眼科剪將髕腱組織剪碎放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，按照體積分?jǐn)?shù)為0.3%加入Ⅰ型膠原酶溶液(3 g·L-1)消化2.5 h。通過(guò)70 μm濾器形成單細(xì)胞懸浮液后，以300×g離心5 min去除上清。用無(wú)菌PBS洗滌2次。將細(xì)胞沉淀用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LG-DMEM、10%FBS、100 U·ml-1青霉素、100 mg·ml-1鏈霉素)重新懸浮后，以50個(gè)有核細(xì)胞·cm-2的密度接種到20 cm2的培養(yǎng)皿中，3 d后用無(wú)菌PBS洗滌兩次后去除未貼壁細(xì)胞，7～10 d后用0.25%胰酶消化克隆樣生長(zhǎng)的細(xì)胞，并標(biāo)記為原代細(xì)胞(P0)。在細(xì)胞生長(zhǎng)濃度達(dá)到90%培養(yǎng)瓶底后傳代細(xì)胞，取第3代(P3)細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 大鼠TDSCs成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 取P3的DM組TDSCs(dTDSCs)和對(duì)照組TDSCs(hTDSCs)，按4×10 cm3的細(xì)胞濃度接種于6孔板。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基下培養(yǎng)至細(xì)胞融合，然后將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含500 μmol·L-1異丁基甲基黃嘌呤、500 nmol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1吲哚美辛、10 mg·L-1胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。每3 d更換誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至第9天時(shí)，將兩組細(xì)胞分別行油紅O染色檢測(cè)脂滴形成情況，并作定量檢測(cè)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)成脂相關(guān)基因(C/EBP和PPARγ2)在mRNA水平的表達(dá)。

1.2.4 油紅O染色及其定量檢測(cè) dTDSCs和hTDSCs成脂分化誘導(dǎo)后第9天時(shí)行染色，吸去培養(yǎng)液后用無(wú)菌PBS沖洗兩遍；用10%的甲醛室溫固定20 min后用60%的異丙醇輕柔沖洗兩次，隨后用0.3%油紅O溶液每孔1 ml室溫染色1 h，小心去除未結(jié)合染料，用雙蒸水漂洗兩遍后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。用異丙醇按照每孔1 ml孵育1 h后，取溶解充分的溶液用分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值作油紅O染色的定量檢測(cè)[7]。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)成脂分化相關(guān)基因 將dTDSCs和hTDSCs成脂分化誘導(dǎo)第9天時(shí)，用無(wú)菌PBS沖洗兩遍，用Rneasy試劑盒提取兩組細(xì)胞的總RNA后根據(jù)First-Strand cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。C/EBPα和PPARγ2的引物序列見(jiàn)表1。參考SYBR Green qPCR試劑盒說(shuō)明，使用ABI Stepone Plus上機(jī)，循環(huán)條件如下：95 ℃下變性10 min；95 ℃下20 s，最佳退火溫度下30 s，72 ℃下30 s，循環(huán)45次；最后在60～95 ℃按照0.1 ℃·s-1加熱速率進(jìn)行加熱測(cè)量溶解曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)ABI Stepone Plus系統(tǒng)軟件分析，靶基因以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，相關(guān)基因表達(dá)通過(guò)2-ΔCT公式計(jì)算。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較通過(guò)秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，所有P值均表示雙側(cè)概率。

2 結(jié) 果

2.1 DM組與對(duì)照組血糖值及體重的變化

對(duì)照組大鼠接受檸檬酸鹽腹腔注射后血糖值無(wú)明顯變化，兩周之內(nèi)血糖均值為(75.08±1.67)mg·dl-1；DM組大鼠予STZ 65 mg·kg-1腹腔注射后第3天起血糖值均高于250 mg·dl-1，兩周之內(nèi)血糖均值為(426.53±9.51)mg·dl-1，顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，提示DM模型建造成功。在造模前對(duì)照組和DM組大鼠體重分別為(239.33±3.51)g和(239.67±2.52)g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而造模后到處死取材前，DM組大鼠體重為(219.67±1.53)g，較對(duì)照組的(255.67±3.06)g顯著降低(P=0.02)。

表1qRT-PCR中使用的引物序列及退火溫度

Tab1ThesequencesandannealingtemperatureofthetargetgenesinqRT-PCRassay

基因 引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃GAPDH5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'(正向) 5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'(反向)14860PPARγ25'-CGGCGATCTTGACAGGAAAG-3'(正向) 5'-GCTTCCACGGATCGAAACTG-3'(反向) 17459C/EBP5'-AAGGCCAAGAAGTCGGTGGA-3'(正向) 5'-CAGTTCGCGGCTCAGCTGTT-3'(反向)18955

2.2 兩組大鼠TDSCs的形態(tài)學(xué)觀察

按照我們之前研究中提取TDSCs的方法[3]，以50個(gè)·cm2接種培養(yǎng)后，兩組細(xì)胞均為克隆樣生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)至P3時(shí)：對(duì)照組hTDSCs的形態(tài)保持相對(duì)均一，呈現(xiàn)典型的細(xì)長(zhǎng)紡錘型(圖1A)；而DM組dTDSCs鏡下表現(xiàn)為多突的紡錘型，細(xì)胞核相對(duì)較大(圖1B)。

圖1大鼠髕腱來(lái)源肌腱干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察×100
A. hTDSCs呈現(xiàn)典型的長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一；B. dTDSCs細(xì)胞核較大，主要表現(xiàn)為多突的紡錘形

Fig1ThemorphologyoftheTDSCsfrombothgroups(×100)

2.3 TDSCs成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色結(jié)果

hTDSCs在成脂誘導(dǎo)9 d后，低倍鏡下大部分細(xì)胞有大量的被油紅O染色的脂滴形成(圖2A)，高倍鏡下hTDSCs細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，形成的脂滴分布在細(xì)胞核周圍胞質(zhì)內(nèi)(圖2B)；而dTDSCs在相同誘導(dǎo)條件作用下，低倍鏡下僅有少量的dTDSCs有脂滴形成(圖2C)，高倍鏡下細(xì)胞也存在微小的圓形樣改變，胞質(zhì)內(nèi)有少量的脂滴形成(圖2D)。定量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組在570 nm處吸光度值顯著下降(P<0.001，圖2E)。

2.4 TDSCs成脂誘導(dǎo)分化相關(guān)基因的表達(dá)

qRT-PCR比較成脂分化特異性基因的表達(dá)顯示，dTDSCs的PPARγ2、C/EBP mRNA表達(dá)水平均顯著低于hTDSCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，見(jiàn)圖3A、B。

3 討 論

隨著越來(lái)越多的臨床研究提示DM與肌腱病變之間存在一定的聯(lián)系，DM肌腱病變的研究也越來(lái)越受到臨床醫(yī)生和研究人員的關(guān)注[2]。STZ作為一種胰島B細(xì)胞毒性藥物，在很多研究中用來(lái)構(gòu)建1型DM動(dòng)物模型[4-5,8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)一次性腹腔注射STZ-檸檬酸鹽緩沖液成功建造了DM大鼠模型，DM組SD大鼠機(jī)體處于持續(xù)的高血糖狀態(tài)。而且DM大鼠的體重在造模兩周后較對(duì)照組顯著降低，而體重減輕也是1型糖尿病的特征之一[9]。

圖2兩組TDSCs成脂分化9d后油紅O染色結(jié)果A、C×100；B、D×400低倍鏡下hTDSCs(A)較dTDSCs(C)有更多的紅色脂滴形成； 高倍鏡下hTDSCs(B)成脂分化的細(xì)胞形態(tài)變圓，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的紅色脂滴，而dTDSCs(D)胞質(zhì)內(nèi)僅見(jiàn)少量的紅色脂滴形成； E. 定量分析油紅O染色結(jié)果，dTDSCs與hTDSCs比較，P<0.001

Fig2Theresultsoftheadiopgeicdifferentiationfor9daysofbothhTDSCsanddTDSCs

圖3兩組TDSCs成脂分化基因的mRNA表達(dá)情況
A. dTDSCs的PPARγ2 mRNA表達(dá)水平與hTDSCs比較，P=0.01； B. dTDSCs的C/EBP mRNA表達(dá)水平與hTDSCs比較，P=0.01

Fig3TheresultsoftheexpressionofadipogenicdifferentiationgenesatmRNAlevel

我們?cè)诩韧膶?shí)驗(yàn)中已經(jīng)成功建立了從髕腱中分離培養(yǎng)TDSCs的方法[3]。本實(shí)驗(yàn)中，我們按照此方法在模型建成兩周后，分別從DM組和對(duì)照組中提取dTDSCs和hTDSCs進(jìn)行成脂分化潛能的比較研究。

在體外成脂分化9 d后，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)hTDSCs和dTDSCs細(xì)胞周圍均有透亮的脂滴形成，油紅O染色顯示兩種TDSCs均能成脂細(xì)胞分化。hTDSCs胞質(zhì)內(nèi)有大量的紅色脂滴，而dTDSCs胞質(zhì)紅色脂滴顯著少于hTDSC；qRT-PCR結(jié)果提示dTDSCs的PPARγ2、C/EBP mRNA水平較hTDSCs顯著降低。研究表明，PPARγ2和C/EBP對(duì)干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中在轉(zhuǎn)錄水平起到重要的調(diào)控作用，其他脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因如GLUT4、OB和SCD1等在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)含有功能性的PPARγ2和C/EBP的結(jié)合位點(diǎn)[10]。這提示在體外相同的條件下誘導(dǎo)dTDSCs和hTDSCs，DM肌腱干細(xì)胞成脂分化潛能顯著降低。這些結(jié)果和Nadler等[11]的報(bào)道一致，他們通過(guò)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)DM小鼠成脂相關(guān)基因的表達(dá)降低。

然而引起DM TDSCs成脂分化能力降低的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。我們?cè)诩韧难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，體外高糖環(huán)境可以抑制肌腱干細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡并導(dǎo)致其成肌腱分化能力降低[12]。目前的研究顯示,胰島素是一種高效的促進(jìn)脂肪形成因子，它能引起脂肪前體細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成脂分化轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞成脂肪細(xì)胞樣分化[13]。Lehner等[14]的報(bào)道中指出，正常的肌腱中也存在著一類能夠分泌胰島素的肌腱細(xì)胞，這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)干/祖細(xì)胞標(biāo)志物nestin、scleraxis以及胰高血糖素和胰島素，因而這些細(xì)胞可能為TDSCs，提示TDSCs在機(jī)體內(nèi)也有可能通過(guò)分泌胰島素從而調(diào)節(jié)局部組織內(nèi)的血糖水平；而STZ引起DM大鼠胰島B細(xì)胞廣泛破壞，體內(nèi)由胰島B細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素顯著降低引起DM大鼠體內(nèi)持續(xù)的高血糖，從而肌腱內(nèi)局部升高的血糖水平刺激肌腱干細(xì)胞產(chǎn)生胰島素，反饋性調(diào)控局部血糖。因此我們推測(cè)胰島素及其相關(guān)因子可能是導(dǎo)致DM TDSCs成脂分化能力降低的關(guān)鍵因子，這些有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，與正常的SD大鼠髕腱來(lái)源的TDSCs相比，STZ誘導(dǎo)的DM大鼠髕腱來(lái)源的TDSCs成脂分化能力顯著下降，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步揭示DM肌腱病變過(guò)程中持續(xù)體內(nèi)高糖環(huán)境對(duì)TDSCs成脂分化功能影響的潛在分子機(jī)制提供了細(xì)胞生物學(xué)依據(jù)。

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