IGF-1對多發(fā)性抽動癥模型大鼠紋狀體神經(jīng)元氨基酸遞質(zhì)水平及細(xì)胞凋亡的影響

伍俊伊，曾曉云

(武漢市普愛醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

小兒多發(fā)性抽動癥(tourette syndrome，TS)是以發(fā)音異常和多種運(yùn)動為特征的人類神經(jīng)障礙性疾病。臨床表現(xiàn)為不自主的、無目的的單一或多部肌群的收縮，如眨眼、皺眉、搖頭、聳肩等運(yùn)動[1]。目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)回路中神經(jīng)遞質(zhì)失衡一直是學(xué)者們探索的主流方向，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多巴胺(DA)系統(tǒng)功能異常及相關(guān)遞質(zhì)(受體)表達(dá)失衡可能是其主要發(fā)病機(jī)制，但隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)氨基酸類遞質(zhì)與TS的發(fā)生密切相關(guān)[2]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)可減緩肌萎縮側(cè)索硬化癥病情惡化[3]。IGF-1對戊四唑誘導(dǎo)的幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)增殖[4]。研究表明，TS患兒血清IGF-1含量顯著下降，且可作為其診斷的輔助檢測指標(biāo)[5]。本研究探討IGF-1對TS模型大鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)氨基酸遞質(zhì)水平及細(xì)胞凋亡的影響，以期為TS的臨床治療和藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性Wistar大鼠24只，體重(220±30)g，購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK(鄂)2015-0007，動物實(shí)驗(yàn)遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)下意見》的相關(guān)規(guī)定。大鼠分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)1周，室溫(22±2)℃，濕度50%～70%，通風(fēng)，晝夜節(jié)律為12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 亞氨基二丙腈(IPDN)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛購自美國Sigma公司，重組IGF-1購自美國Chemicon公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、半胱天冬酶-3(caspase-3)一抗購自南京碧云天生物技術(shù)公司，GAPDH一抗、兔抗鼠二抗購自武漢博士德公司，磷酸氫二鈉、高氯酸、無水甲醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 24只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為3組：對照組大鼠注射與各組藥物等體積的生理鹽水；模型組大鼠注射腹腔注射IPDN，劑量為350 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)給藥7 d；治療組大鼠先腹腔注射IPDN，劑量及時間與模型組一致，第7天注射完后6 h再注射重組IGF-1 1次，劑量為0.1 mg·kg-1。IGF-1采用腦立體定位注射，藥物使用生理鹽水稀釋至終濃度為6 μg·μl-1，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后固定于腦立體定位儀，按腦立體定位圖譜用微量注射器注射，注射完后停針15 min，縫合傷口，繼續(xù)喂養(yǎng)7 d。

1.2.2 TS模型建立判斷 大鼠腹腔注射IPDN造模7 d后，模型鼠均出現(xiàn)不同程度的刻板行為(頭部抽動、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動)和運(yùn)動行為(探究活動增加)，尤其刻板行為表現(xiàn)明顯且易分辨，提示TS大鼠模型建立成功。

1.2.3 刻板運(yùn)動評分 分別于給藥后即刻及3、5、7 d對大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，參照Khan等[6]的方法并加以改進(jìn)。將大鼠放置于單獨(dú)的觀察籠內(nèi)，室內(nèi)環(huán)境安靜、避光，適應(yīng)5 min后使用數(shù)碼攝錄機(jī)進(jìn)行大鼠行為的攝像，同時采用雙盲法對大鼠刻板運(yùn)動進(jìn)行評分，評分時間為2 min，具體標(biāo)準(zhǔn)：無刻板運(yùn)動記0分，有旋轉(zhuǎn)行為記1分，頭部垂直運(yùn)動記2分，頭部垂直運(yùn)動和旋轉(zhuǎn)行為記3分，頭側(cè)擺伴頭部垂直運(yùn)動記4分。取兩人評分的平均值并記錄結(jié)果。

1.2.4 高效液相色譜法測定紋狀體內(nèi)Glu、GABA含量 將大鼠在最后一次給藥24 h后斷頭處死，快速分離出紋狀體，用干凈鋁箔包好置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。稱取紋狀體組織30～50 mg，加0.35 ml預(yù)冷的勻漿工作液，冰浴下使用電動微量勻漿器快速勻漿，靜置10 min，4 ℃下14 000×g離心15 min，取上清液，用離心式過濾器7 000 r·min-1離心過濾，再用0.05 mol·L-1高氯酸10倍稀釋，取20 μl放入自動進(jìn)樣器中待測。色譜條件：預(yù)柱為Shiseido，Guard Cartridge，Capcell C18 MG S-5，4.0 mm×10 mm；色譜柱：Waters XterraTM MS(3.0 mm×50 mm，2.5 μm)；流動相為100 mol·L-1磷酸氫二鈉，25%甲醇，10%乙腈，用磷酸調(diào)pH至6.70；流速：0.6 ml·min-1；衍生方法：取50 μl OPA/β-巰基乙醇加入到20 μl稀釋后的紋狀體組織勻漿液中，衍生2 min后上樣，進(jìn)樣量為20 μl，柱溫40 ℃，設(shè)置2道電勢為150和550 mV。

1.2.5 蛋白印跡法檢測NF-κB、caspase-3蛋白的表達(dá) 使用細(xì)胞蛋白裂解液將紋狀體組織充分裂解完全，離心后吸取上清，采用BCA法測定總蛋白濃度，小管分裝后加上樣緩沖液，沸水浴使蛋白高溫變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉，NF-κB、caspase-3、GAPDH一抗孵育4 ℃過夜，洗膜后二抗孵育，洗膜后暗房顯影。蛋白表達(dá)半定量采用條帶灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 刻板運(yùn)動評分比較

對照組大鼠各個時間點(diǎn)均無刻板運(yùn)動發(fā)生，模型組和治療組大鼠各個時間刻板運(yùn)動評分詳見表1。與模型組相同時間比較，治療組大鼠IGF-1處理后5、7 d的刻板運(yùn)動評分顯著減少(P<0.05)。

表1模型組與治療組大鼠給藥后不同時間點(diǎn)的刻板運(yùn)動評分

組 別n不同時間點(diǎn)刻板運(yùn)動評分0 d3 d5 d7 d模型組82.48±1.162.32±1.212.57±1.252.63±1.49治療組82.53±1.242.06±1.351.41±0.831.07±0.72t值0.0830.4062.1872.666P值0.9350.6910.0460.018

2.2 紋狀體Glu、GABA含量比較

與對照組比較，模型組大鼠紋狀體Glu、GABA含量顯著上升(分別t=5.037、t=4.855，均P<0.05)，治療組紋狀體Glu、GABA含量也顯著上升(分別t=2.759、t=2.622，均P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠IGF-1處理后紋狀體Glu、GABA水平明顯降低(分別t=2.457、t=2.213，均P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠給藥后紋狀體內(nèi)Glu和GABA含量

μg·g-1

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.3 紋狀體組織NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)

與對照組比較，模型組大鼠紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(均P<0.05)，治療組紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)水平也顯著上升(均P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠IGF-1處理后紋狀體NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)。見圖1。

3 討 論

TS發(fā)病與DA、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)失衡有關(guān)[1]。目前研究表明，腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異?？赡軈⑴cTS發(fā)展[2]。TS患者腦內(nèi)Glu水平升高使中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈過度興奮狀態(tài)，抑制Glu過度釋放可有效改善TS及其合并癥發(fā)生[7]。TS病人血清GABA含量升高，推測GABA參與TS發(fā)展[8]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠紋狀體內(nèi)Glu和GABA含量與對照組比較顯著上升，與上述報(bào)道結(jié)果一致，說明TS發(fā)病與腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)水平異常有關(guān)。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

圖1各組大鼠紋狀體凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、caspase-3表達(dá)情況

IGF-1又稱生長調(diào)節(jié)素C，與機(jī)體組織修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)等有關(guān)[9-10]。研究表明，運(yùn)動神經(jīng)障礙患者腦脊液中IGF-1含量較之健康對照者明顯減少[11]；帕金森病患者血清IGF-1水平也顯著低于健康對照組[12]；皮質(zhì)下缺血性腦血管病患者血清IGF-1水平明顯降低，且與認(rèn)知功能損害呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射給予IGF-1能夠抑制TS大鼠刻板運(yùn)動行為的發(fā)生，降低紋狀體內(nèi)氨基酸遞質(zhì)Glu和GABA的含量，延緩TS癥狀發(fā)展，但確切的作用分子機(jī)制有待將來更深入的研究。

IGF-1受體廣泛分布于人體各組織器官，在中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)DA能神經(jīng)元中亦有表達(dá)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1具有神經(jīng)保護(hù)作用；IGF-1可抑制左旋多巴對神經(jīng)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用[13]；IGF-1基因敲除小鼠紋狀體微白蛋白神經(jīng)元嚴(yán)重脫失[14]。研究表明，IGF-1抑制細(xì)胞凋亡與減少促凋亡因子caspase-3合成、降低Bax/Bcl-2之值、減少細(xì)胞色素C釋放等相關(guān)[15-16]。本研究結(jié)果表明，IGF-1可通過抑制caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)對TS紋狀體神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，IGF-1對TS大鼠紋狀體神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能與其下調(diào)紋狀體內(nèi)氨基酸遞質(zhì)水平及凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 姚陽,劉坤,楊宇,等.異鉤藤堿對多發(fā)性抽動癥模型大鼠頭部抽動行為與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)水平的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志,2016,25(1):29-33.

[2] 張雯,王素梅,王道涵,等.健脾止動湯對多發(fā)性抽動癥模型小鼠抽動行為及紋狀體內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志,2013,22(8):700-703.

[3] LUNETTA C,SERAFINI M,PRELLE A,et al.Impaired expression of insulin-like growth factor-1 system in skeletal muscle of amyotrophic lateral sclerosis patients[J].Muscle Nerve,2012,45(2):200-208.

[4] 李文斌,龔亮.胰島素樣生長因子-1對幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的神經(jīng)保護(hù)作用的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(22):28-33.

[5] 秦賀玉,姚寶珍.血清胰島素樣生長因子 1水平與多發(fā)性抽動癥患兒的關(guān)系[J].中國綜合臨床,2015,31(2):1145-1148.

[6] KHAN H A,ALHOMIDA A S,ARIF I A.Neurovestibular toxicities of acrylonitrile and iminodipropionitrile in rats:a comparative evaluation of putative mechanisms and target sites[J].Toxicol Sci,2009,109(1):124-131.

[7] MüLLER-VAHL K R,CATH D C,CAVANNA A E,et al.European clinical guidelines for Tourette syndrome and other tic disorders.Part IV:deep brain stimulation[J].Eur Child Adolesc Psychiatry,2011,20(4):209-217.

[8] WANG S,QI F,LI J,et al.Effects of Chinese herbal medicine Ningdong Granule on regulating dopamine(DA)/serotonin(5-TH) and gamma-amino butyric acid(GABA) in patients with Tourette syndrome [J].Biosci Trends,2012,6(4):212-218.

[9] OKI K,LAW T D,LOUCKS A B,et al.The effects of testosterone and insulin-like growth factor 1 on motor system form and function [J].Exp Gerontol,2015,64:81-86.

[10]吳亞平,郭新躍,張婧婧,等.重組人生長激素治療糖尿病足對血漿胰島素樣生長因子-1及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3水平的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2017,45(10):1489-1492.

[11]BILIC E,RUDAN I,KUSEC V,et al.Comparison of the growth hormone,IGF-1 and insulin in cerebrospinal fluid and serum between patients with motor neuron disease and healthy controls[J].Eur J Neurol,2006,13(12):1340-1345.

[12]黃嶸,王翀.帕金森病患者血清一氧化氮,胰島素樣生長因子 1 及 S-100B 蛋白水平關(guān)系的研究[J].疑難病雜志,2014,13(1):40-41.

[13]賀榮霓,謝惠芳,劉振華,等.JAK/STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在 IGF-1 抑制左旋多巴誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡中的作用[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(5):475-479.

[14]MARSHALL J,DOLAN B M,GARCIA E P,et al.Calcium channel and NMDA receptor activities differentially regulate nuclear C/EBPβ levels to control neuronal survival[J].Neuron,2003,39(4):625-639.

[15]KANG B P,URBONAS A,BADDOO A,et al.IGF-1 inhibits the mitochondrial apoptosis program in mesangial cells exposed to high glucose[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,285(5):F1013-F1024.

[16]陳琪,步仰高,王楊,等.IGF-1 對缺氧缺血性腦損傷新生小鼠腦細(xì)胞線粒體 Cyt-C,caspase-3 表達(dá)的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(10):1422-1427.