生物修復對黃土壤中石油烴的去除作用及影響因素

吳蔓莉，張 晨，祁燕云，葉茜瓊，祝長成

（西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室，西安 710055）

西北地區(qū)是我國重要的石油生產地，石油的開采在給當地帶來經濟效益的同時，不可避免地帶來環(huán)境污染問題。目前西北地區(qū)的石油污染土壤問題十分嚴重，許多學者對當地的石油污染情況進行了調查研究[1-2]。劉培等[3]的調查結果表明，陜北某采油區(qū)油井周圍石油烴含量高達10 850～13 488 mg·kg-1，是土壤背景值的21～27倍，石油污染使土壤在有機質含量、總烴含量及生態(tài)毒性等方面均達到重度污染水平，污染情況十分嚴重。因此，如何有效去除黃土壤中的石油污染物，已經成為當地亟需解決的主要環(huán)境問題。

利用微生物修復法處理石油污染土壤具有成本低、無二次污染等優(yōu)點，目前已成為廣泛采用的土壤修復技術[4-5]。微生物修復技術包括微生物強化（Bioaugmentation）和微生物刺激（Biostimulation）兩種方法[6-7]。微生物強化是指通過向污染場地中投加高效降解菌以加快污染物降解的方法。一般在功能性降解菌數量較少的污染土壤中，利用微生物強化法進行修復效果較好[8-10]。微生物刺激是指通過向污染場地添加烴降解菌生長所需的氮磷等營養(yǎng)元素以及H2O2、O2等電子受體，通過刺激微生物的生長而達到加速降解石油污染物的目的[11-13]。多數研究認為，當土壤的碳氮磷比為100/10/1時，降解菌的活性最強，有利于土壤中污染物的去除[14-15]。

在對油污土壤進行生物修復處理時，石油烴的去除效果既與土壤濕度、pH、通氧量、養(yǎng)分等土壤環(huán)境因素有關，也受土壤功能性微生物數量和活性的影響。楊茜等[13]的研究結果發(fā)現，在對陜北地區(qū)黃土壤進行生物修復時，通過補充氮磷進行生物刺激的修復效果好于投加降解菌進行的生物強化修復。Haghollahi A等[16]的研究結果表明，在利用生物法對沙子、黏質土、粗粒土中的石油烴分別進行270 d的修復時，存在于沙子中的石油烴去除率可達到70%以上，而黏質土中石油烴的去除率僅為23.5%，說明土壤有機質是影響石油烴去除的重要影響因素。研究還發(fā)現當土壤濕度為10%時，對石油烴去除效果較好。繼續(xù)增加土壤濕度對石油烴的去除無顯著性的影響。

盡管文獻對影響石油烴去除的因素進行了研究報道，但是，不同因素對土壤中石油烴去除效果的影響程度存在差異。文獻對于影響修復效果的限制性因素報道相對較少。本論文利用微生物強化和微生物刺激兩種方法對西北地區(qū)石油污染黃土壤進行模擬修復研究，以期確定適合黃土壤中石油污染物去除的生物修復方法，并利用SPSS軟件分析土壤營養(yǎng)物質、降解菌數量及不同組分烴之間的相關關系，以期明確影響黃土壤中石油烴降解的限制性因素。研究結果對于探明黃土壤中石油烴的微生物去除特性及影響石油烴去除的限制性因素具有重要的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及測定方法

石油污染土壤采自甘肅慶陽某油井周圍，土樣經除雜、碎散、過篩（0.85 mm）、混勻后密封儲存在塑料袋中，以備實驗使用。

土壤性質測定方法：土壤含水率、總有機碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷的測定方法見“土壤分析技術規(guī)范”[17]，土壤中石油烴的測定采用超聲波提取-重量法測定[18]，利用層析法分離總石油烴中的烷烴和多環(huán)芳烴并采用GC-MS進行測定[19]。石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數量的測定采用最大可能計數法[20]。測定結果如表1所示。

表1 石油污染土壤的生物與理化性質Table1 Physical and biochemical properties of the petroleum-contaminated soil

1.2 石油烴降解菌群的富集篩選

取5 g石油污染土壤接種于含有50 mL滅菌的磷酸鹽緩沖溶液中，150 r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng) 2 h。吸取5 mL培養(yǎng)液，轉接到以石油烴為唯一碳源的100 mL PBS緩沖液中，相同條件下振蕩培養(yǎng)7 d。如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次，將最后一次培養(yǎng)液在4℃、10 000 r·min-1條件下離心 10 min，棄去上清液，向離心管中加入30 mL PBS緩沖液，搖勻，在相同條件下離心10 min，棄去上清液；如此反復5次。用PBS調節(jié)混菌懸液OD值為1.0（600 nm處測定）。

1.3 實驗方案設計

生物強化修復處理（BA）：向800 g供試土壤中加入1.2中獲得的石油烴降解菌群混菌懸液10 mL（OD600=1.0），使土壤中外加降解菌個數為108cfu·g-1。

生物刺激修復處理（BS）：向800 g土壤中加入1.202 3 g NH4NO3和 0.504 9 g KH2PO4，使土壤 C∶N∶P=100∶10∶1。

自然衰減（CK）：取800 g供試土壤，不進行任何處理作為控制實驗（CK）。

每種處理3個平行，室溫條件下，連續(xù)進行5周的修復。

每周取2 g土樣，分別對土壤中不同組分烴、不同功能降解菌數、不同形態(tài)氮、有效磷含量進行測定。

1.4 數據統(tǒng)計分析和處理

利用SPSS19.0軟件對不同組分烴、土壤氮、磷營養(yǎng)含量以及降解菌數量的測定數據進行統(tǒng)計分析處理。利用單因素方差分析（ANOVA），在P＜0.05水平時對總菌、石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數量、不同形態(tài)氮及有效磷含量、不同組分烴含量進行顯著性檢驗，利用雙變量法（Pearson相關系數）進行相關性分析[21]。

2 結果與討論

2.1 微生物修復對不同組分烴的去除作用

不同修復處理對土壤中總石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的去除情況如圖1a、圖1b、圖1c所示。石油污染土壤中初始石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量分別為18 800±115.4、13 266±500.0、3066±333.3 mg·kg-1。經過5周的修復，自然衰減（CK）土壤中石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量變?yōu)?18 033±233.3、13 516±316.7、2416±50.6 mg·kg-1，三種烴的去除率分別為（4.08±0.02）%、（-1.88±0.01）%、（21.23±0.07）%；生物強化處理的土壤中（BA）石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量為17 916±383.3、13 016±183.3、2050±116.7 mg·kg-1，去除率分別為（4.70±0.03）%、（1.88±0.05）%、（33.14±0.16）%；生物刺激處理的土壤中（BS）石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量為 16 066±66.7、10 350±183.3、2050±216.7 mg·kg-1，三種烴的去除率分別為（14.54±0.01）%、（21.98±0.04）%、（33.14±0.13）%。相比自然衰減和生物強化的修復處理，利用生物刺激修復可對黃土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴起到較好的去除作用。

石油烴組分中，烷烴比多環(huán)芳烴易于被微生物降解[11，14]。但在本研究中，三種不同處理土壤中的烷烴去除率均低于多環(huán)芳烴去除率，可能的原因是由于本次實驗使用的是經過了一次生物修復處理的油污土壤，一些易降解烴類已在第一期修復中大部分被去除。

圖1 土壤中不同組分烴的濃度變化Figure1 The concentrations of different fractional petroleum hydrocarbons in cultivated loessial soil

生物強化技術的核心是投加高效降解菌。但是外源微生物添加至污染土壤中后一般會受到土著微生物的競爭而發(fā)生拮抗，從而影響生物強化處理效果[22-23]。因此，有研究認為從石油污染土壤中直接分離出具有石油降解能力的土著微生物，將其富集后重新投加到石油污染土壤中進行生物強化實驗，會取得較好的修復效果[10，24]。本次研究中，利用從石油污染土壤中富集的降解菌對原污染土壤進行了生物強化修復，對土壤中的多環(huán)芳烴起到了較好的降解作用，但是對烷烴和總石油烴的去除效果相對較差。利用生物刺激法對黃土壤中不同組分石油烴的去除作用較好。

楊茜等[13]對陜北子長石油污染黃土壤進行生物修復研究時發(fā)現，加入氮磷營養(yǎng)進行生物刺激好于投加降解菌進行生物強化的修復效果。劉五星等[25]對南京近郊煉油廠附近的污染潮土進行生物修復處理研究表明，添加氮磷等營養(yǎng)后，土壤中烴降解菌明顯增加，石油降解速率顯著加快，但接種菌劑以及定期翻動對石油烴降解率沒有顯著影響。這些結果說明對于西北地區(qū)石油污染的黃土壤及我國南方一些不同土質的土壤，利用生物刺激法進行修復對石油烴的去除效果好于生物強化修復。

2.2 土壤不同形態(tài)氮的變化規(guī)律

修復過程中土壤不同形態(tài)氮的變化情況如圖2a、圖 2b、圖 2c所示。

土壤中硝態(tài)氮的初始含量為12.4±0.05 mg·kg-1。整個修復過程中CK、BA處理的土壤中硝態(tài)氮的含量基本保持不變，BS處理中由于加入硝酸銨進行生物刺激處理，使得土壤中硝態(tài)氮的含量增加至248.2±3.71 mg·kg-1，修復前3周呈增加趨勢，第4周時開始降低。說明本次修復中對硝態(tài)氮幾乎不利用。

土壤中銨態(tài)氮的初始含量為0.84±0.05 mg·kg-1，BA處理中銨態(tài)氮含量在第1周增加至5.21±0.17 mg·kg-1，第2周后開始降低，修復5周后穩(wěn)定在1.38±0.08 mg·kg-1左右。BS處理中由于添加了硝酸銨，使得土壤中銨態(tài)氮含量增加至210.4±4.32 mg·kg-1，修復1周后，土壤中銨態(tài)氮含量降低為171.6±1.68 mg·kg-1。在此后的3周內持續(xù)降低，修復第5周時降低為97.2±0.43 mg·kg-1。說明在進行生物刺激處理的土壤中微生物在降解石油烴過程中對銨態(tài)氮有所利用。

一些研究認為，生物修復油污土壤過程中存在著氮的遷移轉化及利用過程。葉茜瓊等[11]對西北地區(qū)石油污染黃土壤的修復研究結果表明，合并生物強化與生物刺激處理油污土壤可使總氮、氨氮含量呈先增加、后降低的趨勢，而硝態(tài)氮的含量在修復前期降低，修復后期基本不變。本研究中，修復過程中消耗了銨態(tài)氮，對硝態(tài)氮幾乎不利用?？赡苁怯捎诒敬涡迯椭?，對油污土壤進行了單獨生物強化和生物刺激處理，其土壤修復機制與同時進行生物強化和生物刺激修復的機制有所不同，造成了對不同形態(tài)氮利用上的差異。

圖2 土壤中不同形態(tài)氮濃度變化Figure2 The changes of various of nitrogen in different treatments

2.3 土壤有效磷變化規(guī)律

如圖3所示，土壤中有效磷的初始濃度為11.8±0.14 mg·kg-1，在整個修復過程中，CK處理的土壤中有效磷濃度保持在（12.3±0.15）～（15.6±0.50）mg·kg-1之間，BA處理中，由于投加的菌懸液中有磷酸鹽緩沖液，使土壤中有效磷濃度增加至（22.2±1.20）～（26.2±0.15）mg·kg-1，并在修復期間保持不變；BS 處理中KH2PO4的添加使有效磷的濃度增加至93.5±2.5 mg·kg-1，在修復的第 4、5 周降低至 84.1±1.53 mg·kg-1和87.4±0.75 mg·kg-1。

許多文獻研究認為，向土壤中添加氮磷營養(yǎng)有利于土壤中石油烴的去除[14-15，25]。然而，對于修復過程中有效磷含量變化的研究，文獻報道相對較少。本研究中通過測定修復過程中有效磷的含量變化發(fā)現，生物刺激修復過程中對有效磷有一定的消耗作用，而生物強化修復過程中有效磷的含量基本保持不變。

圖3 土壤中有效磷濃度變化Figure3 The changes of available phosphorus in different treatments

圖4 土壤降解菌數量變化Figure4 The counts of hydrocarbon degraders in different treatments

2.4 土壤微生物變化規(guī)律

如圖4所示，修復處理前，污染土壤中總細菌數和石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數量分別為1.78×108CFU·g-1和 2.95×105、2.95×105、5.75×102MPN·g-1。

與CK與BS相比，BA處理的土壤中石油烴降解菌數量最多，在修復期間達到1.10×107MPN·g-1并基本保持不變；烷烴降解菌數在修復第1周時達到最大（2.85×107MPN·g-1），第 2 周后開始迅速降低，修復結束時降低至2.96×105MPN·g-1；土壤中多環(huán)芳烴降解菌數量在整個修復過程中基本保持不變。

BS處理的土壤中，石油烴、烷烴降解菌數均在修復第2周時達到最大，分別為4.30×107MPN·g-1和1.25×107MPN·g-1，第2周后開始降低，修復結束時石油烴和烷烴降解菌數分別降低至1.60×105MPN·g-1和2.96×105MPN·g-1；土壤中多環(huán)芳烴降解菌在修復第1周時數量最多，由初始時的5.75×102MPN·g-1增加至1.60×105MPN·g-1，第 5 周時減少至 7.08×103MPN·g-1。

土壤微生物是利用生物法去除石油烴的核心資源。許多文獻對于修復過程中降解菌數量變化進行了報道。楊茜[13]、Wu[19-20]、劉五星[25]等的研究結果表明，添加氮磷等營養(yǎng)使土壤中的烴降解菌數量明顯增加，石油降解速率加快。盡管直接投加菌劑也會使土壤中的降解菌數量增加，但是總體上接種菌劑的土壤中降解菌數量比添加氮磷營養(yǎng)的土壤中少。

本研究中，生物刺激作用使土壤中多環(huán)芳烴降解菌數量在修復前期顯著增加，而生物強化處理的土壤中總石油烴降解菌數多于生物刺激處理的土壤。但總體上，與不經處理的土壤相比，生物強化和生物刺激均可顯著增加土壤中石油烴、烷烴降解菌的數量，研究結果與文獻報道基本一致。

2.5 相關性分析

本次研究中，利用生物刺激法（BS）可有效去除石油污染黃土壤中的總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴。為了進一步研究影響不同組分烴去除的主要因素，利用SPSS19.0軟件對生物刺激處理的土壤中不同組分烴含量與降解菌數量以及氮磷含量進行相關性分析。所得結果如表2所示。

BS處理中，土壤石油烴含量與土壤總氮、銨態(tài)氮、有效磷濃度、細菌總數及烷烴降解菌數顯著相關（相關系數分別為 0.641、0.793、0.570、0.693、0.571）；烷烴含量與土壤銨態(tài)氮濃度、石油烴降解菌數顯著相關（相關系數分別為0.508、0.552）；多環(huán)芳烴含量與有效磷濃度顯著相關（相關系數為0.543）；土壤銨態(tài)氮濃度與石油烴降解菌數量、烷烴降解菌數量和細菌總數顯著相關。結果表明，向土壤中添加銨態(tài)氮可刺激土壤中石油烴和烷烴降解菌的生長，進而對土壤中的石油烴和烷烴的降解起到促進作用。影響石油污染黃土壤生物修復作用的限制性因素為土壤中銨態(tài)氮和有效磷含量。

表2 生物刺激處理的土壤中各項指標相關性分析（r）Table2 Correlation analysis of different impact factors in biostimulation treatment（r）

3 結論

（1）經過5周的修復，生物刺激法處理的土壤中石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴去除率分別為14.54%、21.98%和33.14%。與自然衰減和生物強化處理相比，利用微生物刺激法可有效去除黃土壤中的石油烴。

（2）生物刺激修復處理的土壤中銨態(tài)氮濃度隨修復時間的增加而降低，土壤中硝態(tài)氮濃度幾乎不發(fā)生變化，石油烴降解過程中需利用銨態(tài)氮和有效磷，對硝態(tài)氮幾乎不利用。與自然衰減的土壤相比，生物刺激可增加土壤中石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌的數量。

（3）影響石油污染黃土壤生物修復作用的限制性因素為土壤中銨態(tài)氮和有效磷含量，向土壤中添加氮磷營養(yǎng)可刺激土壤中烴降解菌的生長，從而對土壤中不同組分烴的降解起到促進作用。

[1]李小利,劉國彬,許明祥.陜北油田土壤和地表水石油污染特征[J].水土保持研究,2009,16（5）：145-148.

LI Xiao-li,LIU Guo-bin,XU Ming-xiang．Features of oil pollution of soil and surface water in Northem Shaanxi oilfield[J]．Research of Soil and Water Conservation,2009,16（5）：145-148．

[2]黃廷林,解 岳,王曉昌,等．延河沉積物的石油污染調查與分析[J]．環(huán)境工程,2000,18（4）：62-64．

HUANG Ting-lin,XIE Yue,WANG Xiao-chang,et al.An investigation and analysis of petroleum contaminated river sediments of Yanhe River[J]．Environment Engineering,2000,18（4）：62-64．

[3]劉 培,梁繼東,高 偉,等.延安石油開采對周邊黃土污染的調查分析[J].西安交通大學學報,2011,45（7）：123-127.

LIU Pei,LIANG Ji-dong,GAO Wei,et al.Investigation of soil contamination caused by petroleum exploitation in Yan′an[J].Journal of Xi′an Jiaotong University,2011,45（7）：123-127.

[4]盧曉霞,李秀利,馬 杰,等．焦化廠多環(huán)芳烴污染土壤的強化微生物修復研究[J]．環(huán)境科學,2011,32（3）：864-869．

LU Xiao-xia,LI Xiu-li,MA Jie,et al.Enhanced bioremediation of coking plant soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons[J].Environmental Science,2011,32（3）：864-869．

[5]Chaineau C H,Rougeux G,Yéprémian C,et al．Effects of nutrient concentration on the biodegradation of crude oil and associated microbial populations in the soil[J]．Soil Biology&Biochemistry,2005,37（8）：1490-1497．

[6]Abed R M M, Al-Sabahi J, Al-Maqrashi F, et al. Characterization of hydrocarbon-degrading bacteria isolated from oil-contaminated sedimentsin the Sultanate of Oman and evaluation of bioaugmentation and bios －timulation approaches in microcosm experiments[J]. International Biodeterioration& Biodegradation, 2014, 89（4）：58-66.

[7]Taccari M,Milanovic V,Comitini F,et al.Effects of biostimulation and bioaugmentation on diesel removal and bacterial community[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2012,66（1）：39-46.

[8]Taccari M, Milanovic V, Comitini F, et al. Effects of biostimulation andbioaugmentation on diesel removal and bacterial community[J]. InternationalBiodeterioration& Biodegradation, 2012, 66（1）：39-46.

[9]Xu Y H,Lu M.Bioremediation of crude oil-contaminated soil：Comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments[J].Journal of Hazardous Materials,2010,183（1/2/3）：395-401.

[10]Wu M L,Chen L M,Tian Y Q,et al,Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by microbial consortia enriched from three soils using two different culture media[J].Environmental Pollution,2013,178（1）：152-158.

[11]葉茜瓊,吳蔓莉,陳凱麗,等.微生物修復油污土壤過程中氮素的變化及菌群生態(tài)效應[J].環(huán)境科學,2017,38（2）：728-734.

YE Xi-qiong,WU Man-li,CHEN Kai-li,et al.Impacts of bioremediation on microbial communities and different forms of nitrogen in petroleum contaminated soil[J].Environmental Science,2017,38（2）：728-734.

[12]喬 俊,陳 威,張承東.添加不同營養(yǎng)助劑對石油污染土壤生物修復的影響[J].環(huán)境化學,2010,29（1）：6-11.

QIAO Jun,CHEN Wei,ZHANG Cheng-dong.Bioremediation of petroleum contaminated soil by various nutrient amendments[J].Environmental Chemistry,2010,29（1）：6-11.

[13]楊 茜,吳蔓莉,聶麥茜,等.石油污染土壤的生物修復技術及微生物生態(tài)效應[J].環(huán)境科學,2015,36（5）：1856-1863.

YANG Qian,WU Man-li,NIE Mai-qian,et al,Effects and biological response on bioremediation of petroleum contaminated soil[J].Environmental Science,2015,36（5）：1856-1863.

[14]劉五星,駱永明.土壤石油污染與生物修復[M].北京：科學出版社,2015：166-170.

LIU Wu-xing,LUO Yong-ming.Soil petroleum pollution and bioremediation[M].Beijing：Science Press,2015：166-170.

[15]Leys N M,Bastiaens L,Verstraete W,et al.Influence of the carbon/nitrogen/phosphorus ratio on polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by mycobacterium and sphingomonas in soil[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2005,66（6）：726-736.

[16]Haghollahi A.Fazaelipoor M H,Schaffie M.The effect of soil type on the bioremediation of petroleum contaminated soils[J].Journal of Environmental Management,2016,180：197-201.

[17]全國農業(yè)技術推廣服務中心.土壤分析技術規(guī)范[M].二版.北京：中國農業(yè)出版社,2014.

National Agricultural Technology Extension Service Center.Technical specifications for soil analysis[M].2th Edition.Beijing：China Agricultural Press,2014.

[18]U.S.Environmental Protection Agency.N-hexane ex-tractable material（HEM；oil and grease）and silica gel treated N-hexane extractable material（SGT-HEM；non-polar material）by extraction and gravimetry[R].EPA-821-R-98-002,1999.

[19]Wu M L,LI W,Dick W A,et al.Bioremediation of hydrocarbon degradation in a petroleum contaminated soil and microbial population and activity determination[J].Chemosphere,2017,169：124-130.

[20]Wu M L,Dick W A,Li W,et al.Bioaugmentation and biostimulation of hydrocarbon degradation and the microbial community in a petroleumcontaminated soil[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2016,107（3）：158-164.

[21]楊 茜,吳蔓莉,曹碧霄,等.石油降解菌的篩選、降解特性及其與基因的相關性研究[J].安全與環(huán)境學報,2014,14（1）：187-192.

YANG Qian,WU Man-li,CAO Bi-xiao,et al.Isolation of petroleum degrading strains and determination their degrading and gene characteristics[J].Journal of Safety and Environment,2014,14（1）：187-192.

[22]Liu P W G,Chang T C,Whang L M,et al.Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil：Effects of strategies and microbial community shift[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65（8）：1119-1127.

[23]Liu P W G,Whang L M,Yang M C,et al.Biodegradation of dieselcontaminated soil：A soil column study[J].Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers,2008,39（5）：419-428.

[24]Ueno A,Ito Y,Yumoto I,et al.Isolation and characterization of bacteria from soil contaminated with diesel oil and the possible use of these in autochthonous bioaugmentation[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2007,23（12）：1739-1745.

[25]劉五星，駱永明，騰 應，等.石油污染土壤的生態(tài)風險評價和生物修復Ⅲ.石油污染土壤的植物-微生物聯合修復[J].土壤學報，2008,45（5）：994-999.

LIU Wu-xing,LUO Yong-ming,TENG Ying,et al.Eco-risk assessment and bioremediation of petroleum contaminated soilⅢ.phyto-microbial remediation of petroleum contaminated soil[J].Acta Pedologica Sinica,2008,45（5）：994-999.