IL-23R基因多態(tài)性與五邑地區(qū)漢族人群強直性脊柱炎的相關性分析

李秀娟,孫 川,陳衛(wèi)光,黃勝起,許蓓妮,陳建勇

(1．江門市中心醫(yī)院 檢驗科,廣東 江門529000；2.江門市中心醫(yī)院 腎內科;3.江門市新會區(qū)婦幼保健院 檢驗科；4.江門市中心醫(yī)院 感染管理科)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一類病因復雜又缺乏有效治療手段的慢性進行性自身免疫性疾病。大量資料研究表明，在歐洲白種人群中強直性脊柱炎的發(fā)病率約為0.5%，在中國該疾病的發(fā)病率約為0.3%，而在非洲的黑色人種人群該疾病幾乎不發(fā)病；對單卵雙生的人群研究顯示，遺傳度>90%，遺傳因素在AS發(fā)病中占了主導地位。這些研究均提示人群的特異性及遺傳基因易感性在AS發(fā)病機制中具有重要的作用。在所有易感基因中，HLA-B27是和AS相關性最強的，相關性達到了90%以上，是研究最徹底和最深入的一個易感基因。然而，在B27 陽性人群中只有1%-5%最后發(fā)展為AS，提示除了在HLA 區(qū)域存在AS的易感基因外，其他染色體可能也存在著本病的易感基因。近來多項研究發(fā)現(xiàn)基因單核苷酸多態(tài)性在疾病的發(fā)生中起著重要的作用，其中研究提示IL-23R SNPs與AS的發(fā)病存在相關。IL-23R SNPs與AS的相關性研究顯示，不同地區(qū)、不同種族的人群，IL-23R SNPs分布是不一樣的，目前，關于IL-23R SNPs與AS相關性研究結論不一致。

為了探討廣東五邑地區(qū)漢族人群中AS的易感性與IL-23R SNPs是否存在相關，本研究采用Sequenom MassArray質譜陣列技術檢測AS患者白細胞介素-23R 基因5個位點的SNPs，并與健康對照組進行比較。

1 材料與方法

1.1 研究對象

江門市中心醫(yī)院2013年02月-2016年02月住院及門診患者50例并得到患者同意，其中男性38例，女性12例，年齡13-46歲,平均年齡28.01歲。選擇本院體檢中心來體檢的70例健康人作為正常對照組，其中男性51例，女性19例,年齡23-35歲平均年齡30.04歲。兩組性別構成，平均年齡差異在統(tǒng)計學上無顯著區(qū)別義(P>0.05)。所選研究對象之間均無血緣關系，并且詳細詢問過病史。實驗組入選標準：①符合1984年美國風濕病學會修訂的AS診斷標準。AS患者HLA-B27均為陽性。 ②實驗對照組的各項指標均陰性，且為本院體檢中心健康體檢者； 排除標準：①伴有如銀屑病性關節(jié)炎 、類風濕性關節(jié)炎等相關的自身性免疫性疾??；②心腦血管疾病或血液系統(tǒng)疾病；③重型感染及其他感染性疾病如病毒性肝炎及HIV感染者等。

1.2 儀器與試劑

美國ABI公司的ABI veriti-384 PCR儀；Major science 公司的Smart view pro 1100凝膠電泳成像儀；Sequenom,Inc 公司的MassARRAY Analyzer 4.0質譜儀、iPLEX Reagent Kit；BioTeKe Corpration全自動核酸提取儀器。

1.3 方法

1.3.1基因組DNA提取 采集研究對象外周空腹靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝，儲存于-80℃冰箱內備用。采用全血基因提取試劑盒提取DNA，具體步驟：①配制蛋白酶K溶液，在每支粉劑中加入蛋白酶K稀釋液，顛倒混勻，最終濃度為10 mg/ml；②在96孔板1、7列中分別加入15 μl蛋白酶K，核酸釋放劑60 μl，200 μl樣本；③樣本和試劑加好后放入自動化核酸提取儀器中，選取已經設置好的程序提取；④核酸提取結束后將96孔板的第6和第12列含有核酸的洗脫液轉移至干凈的無核酸酶離心管中，使用NanoDrop LITE儀器進行OD值檢測，用1.50%瓊脂糖凝膠跑電泳檢測DNA濃度，DNA合格的樣本， 放置-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SNP點選擇 選取目前研究較多,且與AS相關性分析結論不一致的5個位點：rs11209026、rs11465804、rs10489629、rs7517847、rs1343151。

1.3.3IL-23R的MassArray基因分型方法檢測 根據(jù)SNP位點序列信息，使用sequenom公司的引物設計軟件Assay design 3.1設計PCR反應和單堿基擴展引物，委托華大基因生物公司合成。模板擴增PCR反應:5 μl體系，94℃ 5 min ,45個循環(huán)，每個循環(huán)有3個溫度，94℃ 20 s，56℃ 30 s,72℃ 1 min ，最后72℃延伸3 min ，4℃保存； 單堿基延伸PCR反應：9 μl體系，94℃ 30 s ,40個循環(huán)[ 94℃ 5 s，(5個循環(huán)，每個循環(huán)有2個溫度52℃ 5 s,80℃ 5 s) ]，最后72℃延伸3 min,見表1。

表1 IL-23R序列特異性引物

得到的擴增產物，用樹脂純化，純化后的產物移至SpectroCHIP bioarray上，用質譜儀MALDI-TOF分析，用TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分析圖。

1.4 統(tǒng)計學分析

分別進行基因型頻率及等位基因頻率計算，并且檢驗Hardy-Weinberg平衡和MAF(最小等位基因頻率)。采用直接計數(shù)法計算病例組和對照組間基因型頻率和等位基因頻率。各組間率的比較采用Kappe檢驗；計算P值，優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(95% CI)。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行。

2 結果

所有納入的研究對象均分型成功，所有受試者rs11209026、 rs1343151和rs11465804位點的基因型均為純合子，其中，rs11209026的基因型為GG，rs1343151的基因型為CC,rs11465804的基因型為TT，這與HapMap數(shù)據(jù)庫的報道一致。因此，rs10489629和rs7517847位點用于病例對照研究。用于病例對照研究的2個SNP位點的基因頻率分布均未偏離哈迪溫伯格平衡，表明樣本來源的人群具有群體代表性。

2.1 IL-23R 基因rs10489629位點同AS的相關性分析

rs10489629基因多態(tài)性分型：實驗組和實驗對照組檢出G/G， A/G和 A/A 3種基因型 ；AS患者及對照組間IL-23R基因rs10489629位點G等位基因和A等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 )；GG、AG和AG基因頻率在兩組間的分布有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組攜帶AA基因型頻率顯著高于對照組；基因型回歸分析顯示，攜帶IL-23R基因rs10489629位點AA基因型與GG基因型比較，顯著增加AS的罹患風險(OR=7.161，95%CI=1.488-34.462，P=0.014)；攜帶IL-23R基因rs10489629位點A基因與G基因比較，顯著增加AS的罹患風險(OR=3.247，95%CI=1.699-6.207，P=0.000)；兩組間等位基因頻率與基因型分布結果見表2。

表2 人IL-23R基因 rs10489629基因型和等位基因分布

2.2 IL-23R 基因rs7517847位點的等位基因頻率與基因型分布

rs7517847基因多態(tài)性分型：實驗組和實驗對照組均檢出G/G， G/T和 T/T 3種基因型；實驗對照組與AS患者兩組間IL-23R基因rs7517847位點的等位基因G和等位基因T頻率分布在統(tǒng)計學上無顯著差異(P>0.05)；G/G， G/T和 T/T 3種基因型頻率在實驗對照組與AS患者兩組間的分布無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05 )；在實驗對照組與AS患者兩組間等位基因頻率與基因型分布結果見表3。

表3 人IL-23R基因 rs7517847基因型和等位基因分布

3 討論

SNP是由于單個堿基的變化，如轉換、顛換、插入、缺失等造成的DNA 序列多態(tài)性，在人群中其頻率大于1%。SNP在人類基因組中分布范圍廣且十分穩(wěn)定，在人類復雜疾病病因研究中，探討SNP 與復雜性疾病的關聯(lián)性，一直是揭示疾病基因易感性的最重要途徑。

AS 屬于一種自身性免疫性疾病，該疾病與環(huán)境及遺傳等多種因素有關，同時也屬于多基因遺傳病范疇也稱為復雜性疾病。AS 具有高度遺傳性，和所有多基因遺傳病一樣，許多候選基因與AS的相關性目前尚無明確定論。IL-23是在免疫調節(jié)中起著重要的作用，它是一個由亞單位p19和IL-12的p40通過二硫鍵形成的異源二聚體分子，IL-23通過刺激Thl7細胞發(fā)生異常聚集，從而使Th17細胞產生大量IL-17細胞因子，進而IL-17細胞進一步影響其他多個炎癥性細胞因子的產生和活化，從而發(fā)揮了促炎癥作用及嚴重的自身免疫反應[1]。在AS疾病中IL-23與IL-23R受體結合，誘導IL-17的產生[2]，促使血清中IL-17水平顯著升高，并且血清中IL-17可能通過刺激Kβ受體活化因子配體(RANKL)的表達，從而有助于AS患者骨骼破壞的發(fā)生[3]。IL-23R基因變異體被認為是人類自身免疫性疾病的易感基因，諸如IBD、銀屑病和多發(fā)性硬化癥等發(fā)病均與其有關[4-7]。目前，很多學者的研究顯示[8]，在IL-23R 的基因內存在多個SNP位點與AS的發(fā)病機制有關，但具體的發(fā)生機制不明確。目前大部分觀點認為IL-23R SNP可能通過影響細胞的功能，使IL-23/Th17免疫軸(IL23-IL23R-Th17-IL17) 發(fā)生紊亂，從而導致機體發(fā)生慢性炎癥和組織的損傷[9]。

IL-23R SNPs與AS的相關性研究顯示，不同地區(qū)、不同種族的人群，IL-23R SNPs分布是不一樣的。陳真[10]對福建地區(qū)AS患者3個IL-23R基因位點進行研究未發(fā)現(xiàn)rs11209032、rs11209026及rs11465804與AS相關，而王新衛(wèi)[11]的課題組研究顯示rs11209032位點的各基因型及等位基因頻率分布在AS與對照組間存在著統(tǒng)計學差異，推測IL-23R可能是AS的一個易感基因。Rahman 等[12]對加拿大人群AS研究顯示，IL-23R基因位點rs10489629、rs2201841及rs11465804與AS有顯著相關性。目前，關于IL-23R SNPs與AS相關性研究結論不一致。鑒于此，本課題對廣東五邑地區(qū)漢族人群的AS患者進行了分析研究。本研究顯示廣東五邑地區(qū)AS患者IL-23R基因rs11209026、 rs1343151和rs11465804位點的基因型均為純合子，其中，rs11209026的基因型為GG，rs1343151的基因型為CC ,rs11465804的基因型為TT，這與陳真、王新衛(wèi)及韓國[10,11，13]的報道一致，但和加拿大的報道不同[12]。原因可能韓國和中國漢族人群都是屬于亞洲地區(qū)，而加拿大屬于歐洲地區(qū)，也進一步驗證了不同地區(qū)及種族IL-23R SNPs分布是不一樣的。因此，我們認為在分析IL-23R SNPs與疾病風險關系時，應將地區(qū)及種族因素考慮在內。

本研究顯示IL-23R基因rs10489629位點在AS患者與對照組間分布存在著顯著的統(tǒng)計學差異。本實驗分析的數(shù)據(jù)包括P值、OR值及95% CI，結果顯示IL-23R基因rs10489629位點，AS患者攜帶AA基因型頻率顯著高于對照組；基因型回歸分析顯示，攜帶IL-23R基因rs10489629位點AA基因型顯著增加AS的罹患風險；攜帶IL-23R基因rs10489629位點A基因與G基因比較，顯著增加AS的罹患風險。說明個體擁有不同的基因型或攜帶不同的等位基因可能與AS的易患性有關。當rs10489629位點存在A等位基因時，通過統(tǒng)計學對AS危險因素分析顯示，95% CI的下限值為1.699 且大于1，從統(tǒng)計學上認為帶有這種等位基因的個體具有相對較高的患AS 疾病傾向，其相對應的等位基因有可能為易感基因。這和國內周林[14]、張吉林[15]及Karaderi T[16]的報道一致。

本研究未發(fā)現(xiàn)IL-23R基因rs751784位點在AS與對照組間存在統(tǒng)計學差異。但本研究提示IL-23R 基因rs10489629位點基因多態(tài)性與AS易感性存在一定的關聯(lián)。因此，進一步說明IL-23R基因在AS發(fā)病機制中的重要作用。截止目前，許多學者認為，IL-23R 基因多態(tài)性在強直性脊柱炎發(fā)病機制中起著關鍵的作用，由于本實驗所選取的對象僅對廣東省五邑地區(qū)的人群、研究的位點不多，并沒有選取IL-23R的所有SNP位點、研究的樣本量也比較小，所以在未來的研究中我們將進一步加大樣本量及擴大研究對象范圍，進一步證實IL-23R基因對AS易感性的關聯(lián)。從而為對AS發(fā)病機制新的認識奠定基礎，為AS的診斷、治療帶來新的前景。

作者簡介：李秀娟(1980-)，副主任技師，碩士，主要從事遺傳分子生物學研究。

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