羊骨酶解液的植物乳桿菌發(fā)酵

韓克光，龐豐平，曹靖，霍乃蕊，張浩，常泓

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801

2 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

3 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442

4 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801

5 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，山西 太谷 030801

骨粉中的鈣以羥磷灰石晶體和無(wú)定型磷酸氫鈣兩種形式存在，蛋白質(zhì)主要以三螺旋結(jié)構(gòu)的骨膠原形式存在，二者很難被機(jī)體吸收和利用[1]。骨膠原在蛋白酶作用下降解為肽和少量氨基酸的同時(shí)，骨礦中的鈣以離子形式釋放出來(lái)。Ca2+是可被機(jī)體直接吸收的有效鈣，作為二價(jià)礦物營(yíng)養(yǎng)，參與體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)、骨骼生長(zhǎng)等許多重要生理過(guò)程[2-3]，是維持機(jī)體全面健康的必需常量元素。經(jīng)不同水解工藝制備的骨膠原肽，腸道對(duì)其的吸收率遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)，且具有促進(jìn)脂質(zhì)代謝、降低血液膽固醇濃度、促進(jìn)機(jī)體免疫力等生理功能[4]，還可促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收[5-6]，所以酶解不僅使骨粉的生物利用度和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大提高，還賦予了其某些生理功能。

植物乳桿菌Lactobacillus plantarum屬腸道正常菌群，食用安全且具有多種益生功能，能通過(guò)胃并在消化道上皮細(xì)胞定殖，改善腸道微環(huán)境[7-8]，有利于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[9]，緩解高脂飲食引起的肥胖癥狀[9-10]，是泡菜中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌[11]，也是基因工程中常用的表達(dá)宿主細(xì)胞[7,12]。在補(bǔ)充了碳源的骨粉酶解液中，植物乳桿菌以肽類(lèi)、氨基酸等為氮源生長(zhǎng)繁殖，分泌的蛋白酶和肽酶可將多肽進(jìn)一步水解為短肽和氨基酸，同時(shí)產(chǎn)生胞外多糖、維生素、有機(jī)酸、抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物[13]。肽鏈越短，越不易引發(fā)超敏反應(yīng)，經(jīng)口攝入就越安全，且大多生理功能強(qiáng)的活性肽均為短肽，所以羊骨酶解液經(jīng)過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵，營(yíng)養(yǎng)將更豐富和全面，功能性將更強(qiáng)，并且還具有了一定數(shù)量的益生菌，骨腥味也可得到部分掩蔽。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)骨粉和骨粉酶解液乳酸菌發(fā)酵的研究極少。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶均是水解羊骨粉的良好工具酶[14]，且二者復(fù)合水解的效果最佳[15]。本研究將以篩選出的產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的乳酸菌對(duì)羊骨的堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解液進(jìn)行發(fā)酵，以游離Ca2+為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵工藝，考察發(fā)酵對(duì)酶解液多肽總量、短肽得率、羥脯氨酸含量及體外抗氧化活性的影響，為禽畜骨的高值利用和新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新思路，可帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)收益，并促進(jìn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈的延伸。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌菌株及試劑

瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus編號(hào)為ATCC 15009，副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei編號(hào)為CGMCC 1.2284，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

清酒乳桿菌Lactobacillus sakei分離自L(fǎng)yocarniBOM-13，該發(fā)酵劑由清酒乳桿菌組成。彎曲乳桿菌Lactobacillus curvatus分離自L(fǎng)yocarniVBL-97，該發(fā)酵劑由肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌組成，分離時(shí)通過(guò)個(gè)體形態(tài)觀察將桿菌和球菌區(qū)別開(kāi)來(lái)，清酒乳桿菌海藻糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，彎曲乳桿菌呈陰性。植物乳桿菌Lactobacillus plantarum分離自L(fǎng)yocarniSHI-59，分離時(shí)直接通過(guò)個(gè)體形態(tài)將其與該發(fā)酵劑中的木糖葡萄球菌和戊糖片球菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。乳酸片球菌Pediococcus acidilactici和戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus分離自L(fǎng)yocamiVBM-60，該發(fā)酵劑中還含有肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，分離時(shí)通過(guò)個(gè)體形態(tài)觀察將片球菌和葡萄球菌鑒別開(kāi)來(lái)，乳酸片球菌海藻糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，戊糖片球菌呈陰性。

堿性蛋白酶 (Activity≥200 000 U/g) 和風(fēng)味蛋白酶 (Activity≥20 U/mg) 為Solarbio產(chǎn)品；1,1-二苯基-2-苦基苯基 (DPPH) 為Sigma產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、福林酚等其他化學(xué)試劑為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

722可見(jiàn)光分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器)、PHS-3C型精密 pH 計(jì) (上海雷磁分析儀器)、HF160W Heal Force 二氧化碳培養(yǎng)箱 (香港力康生物)、Lambda 850紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (美國(guó)PerkinElmer) 等。

1.3 方法

1.3.1 各菌株產(chǎn)蛋白酶能力比較

將乳酸菌各菌株在MRS培養(yǎng)基中活化，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體作為菌種，考察接種量 (1%、2%、3%、4%、5%)、培養(yǎng)溫度 (30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃)、培養(yǎng)基起始 pH (4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、培養(yǎng)時(shí)間 (12、18、24、30、36、42 h)、碳源 (1%葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉) 對(duì)各菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響，確定各菌株產(chǎn)蛋白酶的較適條件。

將各菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液的OD600值調(diào)節(jié)成等值，并以體積比3%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，在各自較適產(chǎn)蛋白酶條件下培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，離心 (8 400 r/min，4 ℃，15 min)，測(cè)定上清液 (粗酶液) 的蛋白酶活力并進(jìn)行比較。

蛋白酶活力測(cè)定：將50 μL濃度為1%的牛血清蛋白，450 μL待測(cè)樣品，與1.5 mL乙酸鈉緩沖液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 混合，37 ℃孵育5 min，以0.5 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，280 nm處測(cè)吸光值。37 ℃每分鐘水解牛血清蛋白產(chǎn)生1 μmoL色氨酸所需的酶量即為一個(gè)酶活單位。酶活(U/mL)=(K×W)/(V×T)，式中K為樣品稀釋倍數(shù)；W為生成的色氨酸量 (μmoL)；V為反應(yīng)液體積(mL)；T為反應(yīng)時(shí)間 (min)。

1.3.2 羊骨酶解液的制備與植物乳桿菌發(fā)酵

新鮮羊骨經(jīng)清洗后加水50% (質(zhì)量比)，高壓(125 ℃，30 min) 并剔除骨表面的殘留物，破碎去除骨髓，加水二次蒸煮去油脂，瀝干后110 ℃干燥6 h，粉碎后過(guò)80目篩制得骨粉。酶解時(shí)骨粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為12%，堿性蛋白酶的添加量為4.25%，調(diào)節(jié)pH至9，45 ℃水解400 min后添加3.65%的風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié) pH至 6，55 ℃水解240 min后殺菌滅酶活[15]。

羊骨酶解液中添加 1%麥芽糖，逐步增加MRS培養(yǎng)基中羊骨酶解液的比例 (10%、20%、30%-100%)，對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行馴化。將馴化后的菌種以一定體積接種到添加 1%麥芽糖的羊骨酶解液中，按響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，硅膠塞封口，搖床培養(yǎng)。

1.3.3 水解指標(biāo)測(cè)定

多肽生成總量的測(cè)定[15]：多肽分子量小于10 kDa，不被 10%三氯乙酸 (TCA) 沉淀，其數(shù)值為樣品中TCA可溶性總氮 (NTAC) 與氨基態(tài)氮(NAA) 的mg數(shù)之差與6.25的乘積。NTAC測(cè)定時(shí)將酶解液或發(fā)酵液與 10%的 TCA等體積混合，5 000 r/ min離心15 min，取上清液按照福林-酚法測(cè)定；NAA用中性甲醛滴定法測(cè)定。

短肽得率的測(cè)定：短肽不被 15%的 TCA沉淀，其數(shù)值 (%) 為在15% TCA中可溶性氮含量(福林-酚法，方法同上) 與樣品中的總氮含量 (凱氏定氮法) 的比值乘100%。

鈣離子含量的測(cè)定：精確稱(chēng)取1.25 g干燥至恒重的CaCO3，加鹽酸助溶于100 mL水中，低溫煮沸2 min去除CO2，冷卻后用10% NaOH中和pH至6-8，定容至500 mL，此即1 mg/mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取25 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水25 mL，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7左右，再加入10 mL NaOH溶液 (2 mol/L)，加入鈣指示劑，立即用1% EDTA滴定，每毫升EDTA溶液相當(dāng)?shù)拟}毫克數(shù) (X) 等于鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(25 mL) 除以滴定時(shí) EDTA消耗的毫升數(shù)。取酶解液或發(fā)酵液樣品5 mL，加入蒸餾水20 mL，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7左右，加水補(bǔ)充至50 mL，再加入3 mL三乙酰胺和2-3滴鉻黑T指示劑，搖勻后立即滴定，直至溶液變成淡藍(lán)色，記錄樣品滴定時(shí)所消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù) (V)，每毫升樣品中含有鈣的毫克數(shù)Y=(V-V0) ×X×1/5，V0表示空白樣消耗的 EDTA 體積。

水解度測(cè)定：蛋白酶每水解一個(gè)肽鍵就會(huì)釋放一個(gè)游離氨基，游離氨基與OPA反應(yīng)生成一種黃色絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)定該絡(luò)合物在340 nm處的吸光度，再根據(jù)下面3個(gè)公式計(jì)算水解度：

公式中htot取值為7.6，ɑ和β分別為1.00和0.40；Serine NH2為每克蛋白中絲氨酸 (Serine) 氨基的毫摩爾數(shù)。OD0、OD1、OD2分別為空白、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品的檢測(cè)值。X為樣品體積 (L)；Y為樣品質(zhì)量 (g)；P為樣品中的可溶性氮含量 (%)。

OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用；配置絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)將 100 mg絲氨酸用去離子水溶解并定容至1 000 mL。

羥脯胺酸 (Hyp) 含量根據(jù)文獻(xiàn)[16]中的方法測(cè)定。

1.3.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

DPPH清除能力：將發(fā)酵上清液與 DPPH溶液 (0.1 mol/L) 等體積混合，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，空白組以等體積95%乙醇代替，記為A2；對(duì)照組以等體積去離子水代替，記作A0，DPPH 清除率=[1- (A1-A2)/A0]×100%[17]。

·OH清除能力：3支具塞比色管，管1和管2中均加入等體積等濃度 (1 mL，6 mmol/L) 的FeSO4溶液 (A)、H2O2溶液 (B) 和水楊酸溶液，再分別加入1 mL蒸餾水和1 mL酶解液；管3中加入等體積的A、B、蒸餾水和酶解液。3支比色管的吸光度值依次記錄為A0、A1和A2，·OH清除率的計(jì)算公式同上[18]。

O2-·清除能力：3支具塞比色管中均加入4.5 mL 0.05 mol/L的 Tris-HCl (pH 8.2) 和 2.0 mL無(wú)水乙醇，混勻后25 ℃水浴20 min。管1加入0.3 mL經(jīng)25 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚；管2加鄰苯三酚后再加入經(jīng)25 ℃預(yù)熱的0.2 mL酶解物；管3再加入0.2 mL酶解物；置室溫準(zhǔn)確反應(yīng)4 min后立即用1.5 mL HCl溶液 (10 mmol/L) 終止反應(yīng)，3支比色管在321 nm處的吸光度值依次記錄為A0、A1和A2，O2-·清除率的計(jì)算公式同上[19]。

1.3.5 乳酸菌活菌計(jì)數(shù)

測(cè)發(fā)酵液的OD600值，估計(jì)其中的菌體數(shù)量，選擇適宜稀釋度涂MRS平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.6 植物乳桿菌發(fā)酵的工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)時(shí)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的植物乳桿菌，分別以 1%、2%、3%、4%、5%的體積比接種至MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活，確定較適接種量。以4%接種量接種 MRS 肉湯，分別在 30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定酶活，確定較適培養(yǎng)溫度。以4%接種量接種，調(diào)節(jié)MRS肉湯的起始pH 至 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定酶活，確定較適pH。調(diào)節(jié)MRS肉湯的起始pH為5.0，以4%接種量接種，37 ℃培養(yǎng)，分別于12、18、24、30、36、42 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活，確定較適培養(yǎng)時(shí)間。分別以1%的蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉代替MRS配方中的葡萄糖，并調(diào)節(jié)起始pH為5.0，以4%接種量接種，37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活，確定較適碳源。

運(yùn)用 Diesign-Expert V 8.0.61軟件的 Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn) (表 1)。表中X1為培養(yǎng)溫度 (℃)，-1、0、1三水平分別為30 ℃、37 ℃和45 ℃；X2為pH，三水平分別為4、5、6；X3為培養(yǎng)時(shí)間 (h)，三水平分別為10 h、12 h和15 h；X4為接種量，三水平分別為 3%、4%和 5%。以發(fā)酵液中的 Ca2+含量為響應(yīng)值，在 Diesign-Expert. V8.0.61 軟件中使用編碼單位對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立模型，并對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)29組試驗(yàn)結(jié)果中的各指標(biāo) (多肽生成量、短肽得率、Ca2+含量、活菌數(shù)) 采用IBM SPSS statistics V21.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用 Prism、Statistix 8.1軟件對(duì)水解指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.01差異極顯著，P<0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌產(chǎn)酶條件的單因素試驗(yàn)及各菌株產(chǎn)酶能力比較

由圖1可知，單因素試驗(yàn)中，L. plantarum所產(chǎn)蛋白酶的活性越來(lái)越高，確定其較適產(chǎn)酶條件(表 2) 并用于響應(yīng)面分析的水平設(shè)定。由于以麥芽糖為碳源利于L. plantarum產(chǎn)蛋白酶，故后續(xù)研究中以1%麥芽糖代替MRS肉湯中的葡萄糖。

用同樣方法確定的其他乳酸菌的較適產(chǎn)酶條件見(jiàn)表2。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵羊骨酶解液的Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及4因素3水平Table 1 Box-Behnken design and 3 levels of 4 factors for L. plantarum fermentation of sheep bone hydrolysates

圖1 植物乳桿菌發(fā)酵的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of single factor tests of L. plantarum fermentation.

表2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌受試菌株的較適培養(yǎng)條件Table 2 Suitable culture conditions for protease-producing lactic acid bacteria strains tested

接種量相同，在確定的較適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)定各受試菌株的產(chǎn)蛋白酶能力不同，如圖 2所示，植物乳桿菌發(fā)酵液中蛋白酶活力最高，戊糖片球菌和瑞士乳桿菌次之。

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表 3所示，利用 Design-Expert軟件，以 Ca2+含量為響應(yīng)值，對(duì)表 3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型：Y(Ca2+)=2 179+108.50X1–1.33X2+3.75X3–6.58X4–238.88X12–222.13X22–79.76X32–106.26X42–68.5X1X2+2.5X1X3–42.5X1X4+50.25X2X3+75.75X2X4+36X3X4。

方差分析結(jié)果 (表4) 表明，所建立的模型達(dá)到顯著水平 (P<0.05)，且失擬項(xiàng)不顯著 (P>0.05)，說(shuō)明可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)植物乳桿菌發(fā)酵羊骨酶解液中的鈣離子釋放情況。并且可知工藝參數(shù)中溫度的線(xiàn)性效應(yīng)、交互項(xiàng)X1X4和X2X3對(duì)Ca2+濃度的影響顯著 (P<0.05)。R2=0.953 9，表明方程可充分?jǐn)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

通過(guò)Design-Expert軟件，得出發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為：pH 5.25，植物乳桿菌的接種量為4.23%，37.32 ℃發(fā)酵13.59 h，預(yù)測(cè)的發(fā)酵液中游離 Ca2+含量為 21.7 mg/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)調(diào)整起始pH 5.5、4%接種量、37 ℃發(fā)酵14 h，發(fā)酵液中實(shí)際Ca2+含量為19.8 mg/mL，比較接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有一定的實(shí)用價(jià)值。經(jīng)測(cè)定，優(yōu)化工藝下發(fā)酵液中的多肽生成總量為112.8 mg/g、短肽得率為92.0%、活菌數(shù)為 94.6×108CFU/mL。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)間相關(guān)性分析

由表5可知，發(fā)酵液中的活菌數(shù)與Ca2+含量和短肽得率呈極顯著正相關(guān) (P<0.01)，說(shuō)明酶解和發(fā)酵過(guò)程中釋放的Ca2+和短肽可促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖，由其分泌的蛋白酶和肽酶反過(guò)來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+的釋放和短肽的生成。相關(guān)性分析結(jié)果還表明，多肽含量與短肽得率呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果與羊骨粉酶解結(jié)果一致[15]。本研究中多肽生成量與乳酸菌活菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而短肽得率與活菌數(shù)呈正相關(guān)，充分說(shuō)明真正促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的是短肽，短肽可作為植物乳桿菌的生長(zhǎng)因子。另外乳酸菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶將多肽水解為短肽的同時(shí)，所產(chǎn)生的游離氨基酸也可作為乳酸菌的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖。

圖2 乳酸菌各受試菌株產(chǎn)蛋白酶能力比較Fig. 2 Comparison of protease producing ability of different lactic acid bacteria strains tested.

表3 植物乳桿菌發(fā)酵羊骨酶解液的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of responsive surface design of fermenting the enzymatic hydrolysates of sheep bone by L. plantarum

表4 L. plantarum發(fā)酵羊骨酶解液發(fā)酵條件回歸方程的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of the regression equation for ossein hydrolysate fermentation conditions of L. plantarum

表5 羊骨酶解液植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)相關(guān)性分析 (n=29)Table 5 Correlation analysis for indices during L. plantarum fermentation of ossein hydrolysates

2.4 發(fā)酵前后各指標(biāo)變化

由表6可知，發(fā)酵使羊骨酶解液的水解度和Ca2+濃度顯著增加 (P<0.01，P<0.05)，所以對(duì)酶解液進(jìn)一步發(fā)酵可大幅提高骨鈣的生物利用度。需要指出的是，骨膠原在水解過(guò)程中可形成一些能與礦物離子螯合的肽[20]，電鏡面掃描分析結(jié)果表明這些肽與溶出的Ca2+確實(shí)形成了螯合鈣[21]，所以在酶解過(guò)程中實(shí)際釋放的 Ca2+要大于實(shí)測(cè)值。和在乳中相同，鈣在羊骨酶解液或發(fā)酵液中也以螯合鈣和游離鈣兩種形式存在[13]。

表6 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)羊骨酶解液各指標(biāo)的影響Table 6 Effects of L. plantarum fermentation on the indices of the sheep bone hydrolysates

羥脯氨酸是骨膠原蛋白的特征性氨基酸，其含量在發(fā)酵液上清液中極顯著增加 (P<0.01)，說(shuō)明植物乳桿菌所產(chǎn)生的蛋白酶和肽酶，其作用位點(diǎn)和/或方式不同于堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，也進(jìn)一步解釋了發(fā)酵使水解度和短肽得率增加的原因。短肽由多肽降解而來(lái)，發(fā)酵液中短肽得率極顯著增加 (P<0.01)，多肽總量卻沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，說(shuō)明酶解還不徹底，植物乳桿菌發(fā)酵可使更多的羊骨膠原轉(zhuǎn)化為肽，從而有利于骨粉的高效轉(zhuǎn)化和充分利用。

2.5 發(fā)酵前后體外抗氧化活性比較

自由基非?；钴S，幾乎可與所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，其中氧自由基是人類(lèi)許多疾病和衰老過(guò)程的重要病理介質(zhì)[22]，這也是為什么具有抗氧化功能的食品當(dāng)前受到人們?nèi)找嬷匾暤脑騕23]。自由基在體內(nèi)的蓄積置機(jī)體于氧化脅迫的危險(xiǎn)狀態(tài)，而人工合成抗氧化劑往往具有健康風(fēng)險(xiǎn)，所以自然來(lái)源的抗氧化食品極其珍貴[23]。

體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果 (圖3) 表明，發(fā)酵后酶解液對(duì)三種氧自由基的清除能力顯著提高，特別是對(duì)·OH的清除能力極顯著提高?？寡趸芰Φ娘@著提高可能是由乳酸菌的代謝產(chǎn)物、抗氧化肽和具有抗氧化作用的游離氨基酸導(dǎo)致。乳酸菌分泌的胞外多糖能夠增加發(fā)酵液的粘度，改善羊骨酶解-發(fā)酵液的風(fēng)味和口感。

利用植物乳桿菌發(fā)酵植物性食品，促進(jìn)抗氧化肽產(chǎn)生和抗氧化物質(zhì)釋放的研究很多[24-25]，但用于動(dòng)物性食材發(fā)酵的研究報(bào)道很少，本研究進(jìn)行了有益的嘗試。

圖3 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)羊骨酶解液體外抗氧化活性的影響Fig. 3 Effects of L. plantarum fermentation on the in vitro anti-oxidant activity of sheep bone hydrolysates.

3 結(jié)論

本研究從分離自發(fā)酵菌劑的7株乳酸菌中篩選出了產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的植物乳桿菌。對(duì)其進(jìn)行馴化，以釋放的Ca2+濃度為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了其發(fā)酵羊骨酶解液的工藝。發(fā)酵過(guò)程中，植物乳桿菌的活菌數(shù)與Ca2+含量和短肽得率呈極顯著正相關(guān)。植物乳桿菌發(fā)酵可使羊骨酶解液中的多肽進(jìn)一步水解為短肽，并釋放出更多的游離Ca2+和羥脯氨酸，發(fā)酵還可使酶解液對(duì)DPPH、·OH、O2-·三種自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。綜上所述，以植物乳桿菌發(fā)酵羊骨酶解液可進(jìn)一步促進(jìn)骨鈣的轉(zhuǎn)化和膠原短肽的生成，并顯著提高其體外抗氧化能力；生成的短肽和Ca2+反過(guò)來(lái)可促進(jìn)植物乳桿菌的繁殖，酶解液的益生功能相應(yīng)增強(qiáng)；乳酸菌產(chǎn)生的維生素、胞外多糖等物質(zhì)使羊骨酶解發(fā)酵液更富營(yíng)養(yǎng)。總之本研究用植物乳桿菌對(duì)羊骨酶解液進(jìn)行發(fā)酵，使其兼具了抗氧化食品、益生食品、補(bǔ)鈣食品的特性，實(shí)現(xiàn)了羊骨的高值利用，為將來(lái)相關(guān)功能產(chǎn)品的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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