兔抗狨猴IgG-HRP標記抗體的制備及初步鑒定

叢日旭，劉先菊，滕永康，向志光，佟　巍，張麗芳，阮研碩，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京　100021)

普通狨猴(common marmoset,Callithrixjacchus)屬于靈長目(primates)狨猴科(callitrichidae)由于具有獨特的微小體型、多胎繁殖、易在籠具環(huán)境里飼養(yǎng)及操作方便、與人類細胞因子或激素的存在交叉反應(yīng)、獨特的行為和認知特點等優(yōu)點[1-2]，被不同生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的研究學(xué)者們廣泛關(guān)注，是腦發(fā)育、行為學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、生殖生理等學(xué)科的重要實驗動物模型[3-5]，尤其是近年來在神經(jīng)學(xué)科方面的研究價值，已逐漸得到有關(guān)學(xué)者的關(guān)注及認可。此外，自2009年以來，國外有關(guān)學(xué)者陸續(xù)報道了轉(zhuǎn)基因狨猴[6-7]，隨著“帕金森綜合征”等轉(zhuǎn)基因狨猴的問世這一突破性進展，又為生物醫(yī)學(xué)的深入探索性研究提供了重要的實驗動物模型，狨猴也因此將進一步發(fā)揮它的研究價值。但由于普通狨猴及其他非人類靈長類患病種類繁多，為了排除患病個體，保障人員安全與提高實驗的準確性，需要建立相應(yīng)的診斷方法。其中血清學(xué)方法是診斷疾病的有效手段之一。

本文鑒于“狨猴微生物、寄生蟲學(xué)檢測標準制定”，制備了兔抗狨猴IgG-HRP并對其工作濃度初步鑒定,為狨猴病原微生物及突發(fā)傳染病的血清學(xué)檢測體系、制定實驗用狨猴病原微生物標準提供了技術(shù)資源。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

狨猴5只，3～4歲，體重280～340 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供[SCXK(京)2014-0011] [SYXK(京)2017-0027]，實驗動物倫理委員會批準號：LYB18003。飼養(yǎng)在實驗動物資源北方中心慢病間狨猴飼養(yǎng)室(普通環(huán)境)。

1.2　主要試劑及儀器

弗氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5881)；辣根過氧化物酶HRP(Sigma, P2088)；BCA試劑盒(Thermo，23227)；瓊脂糖(Biowest，111860)；脫脂奶粉(BD，232100)；TMB (Solarbio, PR1200)；分子蛋白量標準(Thermo Fisher，26619)；Western blotting顯色底物(Millipore，WBKLS0500)。

低溫離心機(Thermo，Heraeus Freso 21 centrifuge)；蛋白分離純化系統(tǒng)(Bio-Rad，DUO-FLOW)；電泳儀(Bio-Rad,163BR10305)；酶標儀(Perkin Elmer EnSpire? 2300 Multimode Plate Reader)；全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 5500)；HiTrapTMProtein G(GE Healthcare，71-7001-00 AR)；Sephacryl TM S-300 High Resolution(GE Healthcare，17-0599-10)。

1.3　實驗方法

1.3.1血清的收集

根據(jù)實驗動物操作規(guī)范,保定狨猴，消毒，采集后肢靜脈血，并結(jié)束時壓迫止血，將血液放于室溫靜置1.5 h后，低溫離心機4℃，4000 r/min，離心20 min，吸取上層血清。

1.3.2狨猴血清IgG純化和純度鑒定

親和層析柱法是利用生物大分子在一定條件下能緊密的結(jié)合(抗原-抗體)，可以將目的抗原從溶液中轉(zhuǎn)移和分離和提純。參考文獻報道的方法[9-13]。安裝預(yù)處理的親和層析柱Protein G 5 mL，紫外監(jiān)測設(shè)為0.05，血清用20 mmol/L，pH 7.0 PBS結(jié)合緩沖液(binding buffer)4.5倍稀釋后過濾(0.45 μm NC)，上樣速度設(shè)為1 mL/min，用50 mL (10倍柱體積(CV))的結(jié)合緩沖液洗去未與protein G結(jié)合的雜蛋白，25 mL(5倍CV)的0.1 mol/L，pH 2.7甘氨酸洗脫液洗脫目的蛋白即狨猴IgG，接收洗脫峰。合并各管蛋白溶液，BCA法測定蛋白含量。

10% SDS-PAGE電泳鑒定親和層析純化狨猴IgG的純度是否符合免疫原的條件。

1.3.3狨猴抗血清的制備和純化

用1.3.2純化的狨猴IgG作為免疫原，對健康成年新西蘭大白兔進行免疫[14],初次免疫采用IgG劑量為每次0.5 mg，與弗氏完全佐劑1∶1混合,采用背部多點皮下注射法每點0.1～0.2 mL，一只動物注射點數(shù)約為8～10點，共計注射每只1 mL。兩周后采用IgG劑量為每次0.25 mg，加強免疫3次，免疫方法同初次免疫。免疫結(jié)束1周后,保定采血(兔耳緣靜脈)， 4000 r/min，20 min，分離血清。

Double immunodiffusion assay, 1%瓊脂糖對血清效價進行測定。

兔抗狨猴抗血清純化及鑒定按照1.3.2進行。

1.3.4兔抗狨猴IgG-HRP的制備和工作濃度測定

采用改良的“簡易過碘酸鈉(NaIO4)標記法”[15]制備兔抗狨猴IgG-HRP。

1.3.4.1用ELISA法測定標記抗體的工作濃度[14]

將親和純化的狨猴IgG，稀釋成10 μg/mL每孔加100 μL(每孔1 μg)，包被96孔酶標板，酶標抗體作倍比系列稀釋(1∶8000，1∶16 000，……1∶512 000)，每孔100 μL分別加入酶標板；溫箱孵育(37℃，1 h)-洗滌-顯色(TMB)-終止反應(yīng)(H2SO4)-讀取OD值(450 nm)，當OD值等于1.0時對應(yīng)的兔抗狨猴IgG-HRP稀釋度，為酶標抗體的適宜工作濃度。

1.3.4.2用Western blotting法[9, 10, 14]檢測兔抗狨猴IgG-HRP及狨猴IgG工作濃度

親和純狨猴IgG，上樣量分別為25、20、15、10、5、2.5 ng；進行10% SDS-PAGE電泳，100 V，2 h；電轉(zhuǎn)PVDF膜，110 V，1 h，將兔抗狨猴IgG酶標抗體用PBST+5%脫脂奶粉(1∶1)做系列稀釋1∶5000、1∶10 000、1∶15 000，與IgG-PVDF孵育(1 h)，洗滌，曝光成像留取結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1　狨猴IgG的親和層析純化

紫外檢測儀顯示出到兩個蛋白質(zhì)吸收峰：結(jié)合緩沖液洗脫的血清中未與protein G親和柱結(jié)合的蛋白所顯示的峰(穿流峰)(見圖1a)；洗脫緩沖液使目的蛋白IgG與親和層析柱分離的峰(洗脫峰)(見圖1b)。收集洗脫峰的液體是與親和柱結(jié)合的狨猴IgG。

注：(a)穿流峰；(b)洗脫峰。圖1　狨猴IgG親和純化紫外監(jiān)測峰圖Note：(a)Passing through the peak.(b)Elution peak.Fig.1　UV-monitoring of the marmoset IgG purified using protein G affinity chromatography

2.2　狨猴IgG的SDS-PAG電泳分析

還原的親和層析狨猴血清IgG(100℃，4 min)，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)R250染色，脫色觀察結(jié)果，其純度可大于95%(見圖2)，除重鏈(55×103)和輕鏈(25×103)，上樣量達到30 μg時未見雜蛋白(見圖2，Lane 4所示)。染色結(jié)果說明親和層析Protein G與狨猴血清IgG具有較強的結(jié)合力，形成了緊密復(fù)合物，得到高純度的狨猴IgG。

注: M為分子蛋白量標準; Lane 1為狨猴血清；Lane 2為穿流峰蛋白；Lane 3～5親和純狨猴，IgG加樣量為20 μg，30 μg，10 μg。圖2　狨猴血清IgG純度電泳鑒定Note. M: Standard protein marker. Lane 1: The complete serum of marmoset; Lane 2: Washed off protein. Lane 3-5: Samples from the protein G affinity chromatograph added 20 μg, 30 μg, and 10 μg loading amount, respectively.Fig.2　Detection of IgG from the marmoset serum purified by affinity chromatography

2.3　狨猴IgG抗血清的效價檢測及純度分析

1.3.3中的兔抗狨猴IgG的血清，中央孔加入1 mg/mL 純化狨猴IgG 10 μL，1～6分別加入10 μL不同倍比稀釋的抗血清，放入濕盒內(nèi)37℃，18 h后觀察抗原、抗體的特異性復(fù)合物的白色沉淀線，由圖可見抗血清的效價達到了1∶64(見圖3 A)。

Protein G親和層析純化兔抗狨猴IgG抗血清的還原型IgG，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳鑒定(見圖3B)，親和層析的得到高純度的抗血清IgG，其純度大于97%。實驗結(jié)果滿足制備酶標抗體的基本要求：抗體純度高、含雜蛋白少、特異性強、效價高。

注：A:兔抗狨猴IgG血清免疫雙擴散效價；B: M為分子蛋白量標準，Lane 1～7抗血清純化IgG，上樣量為30、25、20、15、10、5、2.5 μg。圖3　兔抗狨猴IgG抗體效價檢測和純化Note. A: Double-immunodiffusion of the anti-serum for IgG of marmoset. B: M was standard protein marker. Lane 1-7: The antiserum from the protein-G affinity chromatograph added 30 μg, 25 μg, 20 μg, 15 μg, 10 μg, 5 μg, and 2.5 μg loading amount, respectively.Fig.3　Purification of the rabbit anti-marmoset IgG antibody

2.4　ELISA法測定兔抗狨猴IgG酶標抗體的工作濃度

與狨猴IgG反應(yīng)的不同稀釋度的兔抗狨猴IgG-HRP酶標抗體，OD值分別為3.728、3.705……0.584(見圖4)由此可見,以1∶256 000稀釋時,其OD值為1.037,即1∶256 000為兔抗狨猴IgG-HRP酶標抗體的稀釋度。

圖4　兔抗狨猴IgG-HRP ELISA效價測定Fig.4　Determination of the rabbit anti-marmoset IgG-HRP titer by direct ELISA

2.5　Western blotting法檢測酶標記抗體及狨猴IgG工作濃度

PVDF膜曝光結(jié)果，以1∶15 000稀釋的酶標抗體孵育，并在狨猴IgG加樣量為5 μg可以顯示清晰、特異的印跡反應(yīng)(見圖5)，酶標抗體靈敏度較強，1∶15 000兔抗狨猴IgG-HRP稀釋度及5 μg的IgG可作為Western blotting的最適起始工作濃度。

注：兔抗狨猴IgG酶標抗體稀釋度為1∶15 000，曝光時間10 s顯色；M為蛋白分子量標準； Lane 1～6：親和純狨猴IgG：25、20、15、10、5、2.5 μg。圖5　兔抗狨猴IgG酶標抗體及狨猴IgG 的western blotting工作濃度測定Note. Western blot result of the marmoset IgG specifically responding with 1:15 000 rabbit anti-marmoset IgG-HRP. M: Standard protein marker. Lane 1-6: Samples from the protein-G affinity chromatograph were added 25 μg, 20 μg, 15 μg, 10 μg, 5 μg, and 2.5 μg，respectively.Fig.5　Determination of the working concentration of the rabbit anti-marmoset IgG-HRP and Marmoset IgG by western blotting

3　討論

標記抗體是免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，其質(zhì)量主要取決于標記抗體的純度、敏感性及特異性。本文力求采用高質(zhì)量的辣根過氧化物酶與高效價、HPLC純的兔抗狨猴IgG，通過改良的“簡易過碘酸鈉標記法”制備了兔抗狨猴IgG-HRP酶標抗體，經(jīng)過自裝的SephacrylTMS-300 High Resolution柱子進行分子過濾純化、低溫超濾離心透析濃縮，獲得高質(zhì)量的兔抗狨猴IgG-HRP酶標抗體，經(jīng)ELISA及Western blotting進行鑒定，其純度、敏感性及特異性均符合使用要求。

如圖1所示，用高效液相色譜親和層析法 (high performance liquid affinity chromatography，HPLC)及HiTrapTMProtein G HP親和柱純化得到狨猴血清總IgG，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，其純度95%(見圖2)；免疫兔子獲得兔抗狨猴IgG抗血清(即狨猴IgG多克隆抗體， whole IgG PcAb)，免疫雙擴散測定抗血清效價為1∶64(見圖3A)；再用親和柱純化抗血清IgG，PAGE電泳鑒定HPLC純度97%(見圖3B)。本文目的是制備了兔抗狨猴IgG-HRP標記抗體，其 ELISA工作濃度達1∶256 000(見圖4)，Western blotting工作濃度達1∶15 000，且具有較強的特異性(見圖5)。

本文初步制備了抗狨猴IgG-HRP酶標抗體結(jié)合物，隨著“狨猴微生物、寄生蟲學(xué)檢測標準制定”工作的不斷深入和技術(shù)試劑的需求，會繼續(xù)制備有關(guān)抗狨猴IgG的各種發(fā)光標記抗體、各種酶標記抗體及膠體金標記抗體，以適用于諸如酶組化技術(shù)(APAAP)、酶免疫技術(shù)(EA)、酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)、熒光免疫技術(shù)(FITC)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)(GICT)、流式細胞術(shù)技術(shù)(FCM)、以及Western blotting等技術(shù)，以滿足生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域及狨猴病原微生物檢測的各種需求。

本文最終強調(diào)，實驗動物是實驗動物科學(xué)的重要組成，是生命科學(xué)的基礎(chǔ)支撐、活的“精密儀器”，而實驗動物的標準化和動物實驗的規(guī)范化研究勢必會成為實驗動物科學(xué)的重要工作。在我國，狨猴至今仍被定義為“實驗用動物”，即狨猴作為諸多學(xué)科研究用的非人靈長類實驗動物，目前尚無國家、行業(yè)或地方標準的推出。鑒于目前國內(nèi)市場抗狨猴IgG-HRP酶標抗體的缺乏及“實驗用狨猴地方標準和相關(guān)檢測技術(shù)研究”、“狨猴微生物、寄生蟲等級監(jiān)測地方標準”制定、以及狨猴其他研究工作之所需，實時有效地完成了兔抗狨猴IgG-HRP標記抗體的制備及初步鑒定，為狨猴的血清學(xué)檢測提供了資源。