烏梅噴霧劑與灌胃劑對大鼠放射性口干癥治療比較研究

葉景云，陳佩儀

(廣州中醫(yī)藥大學，廣州　510006)

在我國，頭頸部腫瘤是華南地區(qū)的高發(fā)病，如鼻咽癌、喉癌、甲狀腺腫瘤等，尤其是鼻咽癌，在廣東省的發(fā)病率更高，而甲狀腺腫瘤的發(fā)病趨勢也在明顯上升[1-4]。放射治療逐漸成為鼻咽癌等頭頸部腫瘤主要及重要的治療方法，且早期頭頸部腫瘤放療治愈率高達90%[5]。但在放射治療過程中，由于患者主要的涎腺組織包被在放射治療野內(nèi)，造成了唾液腺不可避免的損傷，唾液腺功能損傷將導致唾液分泌減少，從而促使口腔干燥、口腔黏膜炎及口腔潰瘍等繼發(fā)。從中醫(yī)基礎(chǔ)理論分析，腫瘤患者本身肝腎虧虛，而放射線屬火毒之邪，最易耗氣傷陰，故放射性口干癥是放療后最常見的并發(fā)癥之一。基于“酸甘化陰”理論的烏梅合劑是以烏梅與甘草配伍的針對口干癥而研制的一種新型制劑，目前已通過含漱液及噴霧劑作用于頭頸部腫瘤放療后口干及胃腸道術(shù)后口干病人的臨床試驗[6-8]，亦在成功建立放射性口干癥大鼠模型后以不同濃度烏梅噴霧劑研究其對頜下腺損傷細胞形態(tài)的修復作用。以往對烏梅甘草復方合劑以何種方式用藥才能較好的發(fā)揮其緩解口干的作用鮮有研究，本文分別用噴霧與灌胃兩種給藥方式，比較研究烏梅合劑對放射性口干的治療作用作用，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠112只，6～7周，體重(222.7±18.5)g，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[SCXK(粵) 2013-0034]，動物飼養(yǎng)及實驗操作與廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK(粵)2008-0085]，本實驗符合倫理要求，通過廣州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查批復。

1.2　主要試劑及儀器

烏梅噴霧劑中的烏梅與甘草顆粒劑由廣東省一方制藥有限公司生產(chǎn)(批號：6062401)，烏梅顆粒劑(每包0.7 g，相當于飲片每包5 g)與甘草顆粒劑(每包0.17 g，相當飲片每包1 g)；匹羅卡品(大連美侖)；水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司)；鉀(K)測試盒(南京建成)；鈉(Na)測試盒(南京建成)；a-淀粉酶(AMS)測試盒(南京建成)。

美國醫(yī)用Varian 23EX直線加速器，能量為9 MV，劑量率為3 Gy/min，由廣東省中醫(yī)院大學城分院放療科技術(shù)提供；分光光度計檢測，型號UV1100II(上海天美公司)；微量有機除熱源型超純水，型號WP-UP-UV-20(四川沃特爾公司)；切片機：Leica-RM2015；顯微鏡：奧特 BK-M500 型數(shù)碼顯微鏡；酶標儀：賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；2 mL Eppendorf(EP)管。

1.3　實驗方法

1.3.1造模與分組

112只Wistar大鼠，其中照射組84只，正常組28只。適應環(huán)境3 d，禁飲禁食12 h后，照射組84只Wistar大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，仰臥使唾液腺區(qū)暴露在照射野(1.5×1.5 cm2)，其他部位用2 cm 厚鉛皮遮擋，避免其它部位受到射線影響，麻醉后使用直線加速器一次性照射18 Gy(射線類型：電子線，能量為9 MV，劑量率為3 Gy/min)，分批進行照射，每次6只。所有大鼠照射時間均在上午 8:00～10:00進行，正常組28只不放射，放射性口干動物模型的方法參照本研究團隊已成功建模的方法[9]。噴霧給藥組分組：烏梅組(A1)、匹羅卡品(陽性對照)組(B1)、模型組(C1)、正常組(D1)，每組各14只。灌胃給藥組分組：烏梅組(A2)、匹羅卡品(陽性對照)組(B2)、模型組(C2)、正常組(D2)，每組各14只。

1.3.2噴霧劑與灌胃劑的制備

實驗組噴霧劑的制備，烏梅顆粒劑與甘草顆粒劑按飲片高濃度比例60∶12 g，用20～25 mL雙蒸水溶解，倒入噴霧小瓶，配制成3倍(高)濃度的烏梅噴霧劑。實驗組灌胃劑使用相同烏梅及甘草顆粒劑，按飲片高濃度比例60∶12 g，用200 mL雙蒸水稀釋配置，每次用前新鮮配制。

1.3.3給藥方法

每組均一天三次正常飲食。噴霧組在放射性損傷后每天給藥三次，一人抓取老鼠，一人噴霧給藥，每次噴一下(0.1 mL)。實驗灌胃組每天給藥三次，每次每只2 mL。給藥均在餐前(8:00、12:00、18:00)進行。給藥直至7 d及14 d實驗結(jié)束后統(tǒng)一在上午8:00～10:00取材，每組兩個時間點各取7只大鼠。

1.3.4大鼠唾液樣本的采集

腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，頸部皮下注射毛果蕓香堿(2 mg/kg)刺激唾液分泌，棉球擦盡大鼠口腔唾液，用移液槍收集口腔內(nèi)唾液，將唾液收集在已稱重的 2 mL離心管內(nèi)，收集 20 min,收集過程中離心管置于碎冰中，避免唾液成份變性[10]。

1.3.5唾液樣本的保存及檢測

將收集的唾液樣本于4℃下，10 000 r/min，離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈EP管，-20℃保存，待測活性。Na+、K+用去離子水稀釋10倍、淀粉酶用生理鹽水稀釋200倍，均使用分光光度計檢測。Na+、K+采用比濁法，又稱濁度測定法，為測量透過懸浮質(zhì)點介質(zhì)的光強度來確定懸浮物質(zhì)濃度的方法，是一種光散射測量技術(shù)。唾液淀粉酶采用碘-淀粉比色法，是利用淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖等，在底物濃度已知并且過量的情況下，加入碘液與未分解的淀粉結(jié)合生成藍色復合物，根據(jù)藍色的深淺算出水解的淀粉量，從而計算淀粉酶的活力。

1.3.6腺體指數(shù)及頜下腺組織形態(tài)學觀察評價(HE染色)

實驗結(jié)束處死小鼠后，立即摘取雙側(cè)頜下腺，進行稱重，計算腺體指數(shù)(頜下腺指數(shù)(mg/g)= 頜下腺質(zhì)量(mg)/ 小鼠體質(zhì)量(g)，腺體指數(shù)反映腺體變化，指數(shù)降低提示腺體萎縮及退行性病變[11])。腺體置于4%多聚甲醛中浸泡固定3 h，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片機切片5 μm，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察觀察組織形態(tài)。HE 染色病理結(jié)果由廣州中醫(yī)藥大學病理實驗室協(xié)助測定。

1.4　統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1　體重

由表1可見，各組大鼠體重差異無顯著性(P> 0.05)。造模后除正常組外，模型組及給藥組均有大鼠出現(xiàn)多飲少食、尿黃、張力減弱、精神疲憊、頸部毛發(fā)脫落或者枯燥等癥狀，模型組及灌胃組少數(shù)大鼠出現(xiàn)腸脹氣的現(xiàn)象。

2.2　唾液量及腺體指數(shù)

如表2所示：在放射后第7天，噴霧組內(nèi)正常組(D1)與模型組(C1)比較，正常組唾液量明顯多于模型組，差異有顯著性(P< 0.01)，灌胃組內(nèi)正常組(D2)唾液量多于模型組(C2)，差異有顯著性(P< 0.01)，以此可判斷大鼠放射性口干模型成立；在放射給藥后第7天，噴霧組內(nèi)烏梅組(A1)唾液量及腺體指數(shù)與模型組(C1)及匹羅卡品組(B1)比較，差異均有顯著性(P< 0.05)，灌胃組內(nèi)匹羅卡品組(B2)唾液量與模型組(C2)對照差異有顯著性，而腺體指數(shù)無明顯變化。在放射后給藥第14天，噴霧組內(nèi)烏梅組(A1)唾液量及腺體指數(shù)與模型組(C1)比較差異均有顯著性(P< 0.05)。第7及14天，烏梅噴霧組(A1)唾液量與頜下腺指數(shù)均較烏梅灌胃組(A2)高(P< 0.01或P< 0.05)。

2.3　成份分析

如表3所示，放射性治療后14 d，烏梅噴霧組與烏梅灌胃組比較鈉離子比較，淀粉酶的差異有顯著性(P< 0.01)。噴霧組內(nèi)，烏梅噴霧組與模型組比較，Na+、淀粉酶差異有顯著性(P< 0.05)，相反在灌胃組內(nèi)差異無顯著性(P>0.05)。

表1　各組基線資料的比較

表2　兩種方式對放射性口干癥大鼠唾液量及腺體指數(shù)的影響

注：與C1比，aP< 0.05，aaP< 0.01；與C2比，bP< 0.05，bbP< 0.01；與B1比，cP< 0.05；與A2比，dP< 0.05，ddP< 0.01。

Note. Compared with the C1 group,aP< 0.05，aaP< 0.01. Compared with the C2 group，bP< 0.05，bbP< 0.01. Compared with the B1 group，cP< 0.05. Compared with the A2 group，dP< 0.05，ddP< 0.01.

表3　兩種方式14 d后對放射性唾液腺損傷大鼠唾液成份的影響

注：與C1比較，*P< 0.05；與A2比較，#P< 0.01。

Note. Compared with the C1 group，*P< 0.05. Compared with the A2 group，#P< 0.01.

2.4　各組頜下腺組織形態(tài)學觀察

頜下腺病理變化(HE×200)顯示，放射后7 d，噴霧組及灌胃組內(nèi)正常組腺泡細胞完好，大小均一，導管結(jié)構(gòu)正常而未見明顯病理變化；模型組放射后7 d頜下腺腺泡大小不等，間質(zhì)水腫、有淋巴細胞炎性浸潤，腺泡細胞輕微萎縮，放射后14 d局部腺泡呈空泡變性及壞死。放射后第7天，烏梅噴霧組與烏梅灌胃組相比，頜下腺腺小葉間隙較小，腺體周圍炎性細胞浸潤程度較低，反射后第14天，烏梅噴霧組少量散在單個淋巴細胞浸潤，腺泡大小不一，偶見少量腺泡及導管結(jié)構(gòu)破壞，腺體核固縮數(shù)量減少，未能恢復至正常組水平。而烏梅灌胃組第7天及14天均顯示部分腺體細胞持續(xù)發(fā)生空泡性壞死，腺體細胞核固縮明顯。

注：A: 烏梅組 B: 匹羅卡品組 C: 模型組 D：正常組。圖1　放射后第7天頜下腺病理變化(×200)Note. A: Dark plum group. B: Pilocarpine (positive control) group. C: Model group. D: Normal group.Fig.1　Morphological changes of the submandibular glands of rats at 7th day after irradiation

注：A: 烏梅組 B: 匹羅卡品組 C: 模型組 D：正常組。圖2　放射后第14天頜下腺病理變化(×200)Note. A: Dark plum group. B: Pilocarpine (positive control) group. C: Model group. D: Normal group.Fig.2　The morphological changes of submandibular gland of the rats at 14 days after irradiation

3　討論

本研究利用烏梅甘草合劑分別經(jīng)灌胃和噴霧兩種方式，對比不同給藥途徑對放射性口干癥Wistar大鼠的唾液腺的影響作用。結(jié)果顯示，烏梅甘草合劑通過口腔噴霧給藥，可有效降低放射性損傷唾液腺的萎縮程度及腺體周圍炎癥細胞的浸潤，且通過7 d、14 d的觀察，口腔噴霧給藥可持續(xù)刺激作用于大鼠的唾液腺，并進一步降低其腺泡及導管結(jié)構(gòu)被破壞的程度，這與陳倩怡等[15]放射后高濃度烏梅噴霧劑組的頜下腺腺小葉細胞萎縮程度降低，腺體周圍炎癥細胞浸潤減少的研究結(jié)果相符，提示在放射性口干癥方面，相對于灌胃給藥，口腔噴霧給藥可促進大鼠唾液腺細胞形態(tài)的恢復，但其具體的作用機制仍需進一步的研究。

放射性口干癥大鼠的唾液腺分泌能力受損，唾液量下降。結(jié)果顯示，噴霧組及灌胃組均能提高大鼠唾液量的分泌，且噴霧組效果好于灌胃組，且根據(jù)14 d的唾液量觀察，烏梅噴霧組的唾液量明顯高于模型組，而灌胃組則無明顯變化，這與謝秀榮等[6]臨床試驗中烏梅噴霧劑可有效緩解頭頸部腫瘤患者放療后第2周的口干癥狀相符。兩組組內(nèi)的模型組大鼠唾液量均呈進行性下降的趨勢，這與Vissink等[16]放射后腺體唾液流率明顯下降的研究結(jié)果相符，但目前尚未有關(guān)于烏梅合劑在噴霧及灌胃途徑方面對大鼠唾液腺分泌的影響作用方面的文獻。

放射性口干癥大鼠的唾液成分也因不同的給藥途徑而改變。結(jié)果顯示烏梅噴霧劑對放射性唾液腺損傷大鼠早、中期唾液Na+、K+及唾液淀粉酶成分有一定的影響，噴霧途徑可增加鈉鉀的比值，同時增加唾液淀粉酶的活性，后期研究中可延長烏梅噴霧及灌胃途徑對大鼠唾液成分影響作用的觀察周期，從而進一步分析不同途徑對唾液成分作用的有效時間。

相比于烏梅灌胃劑，烏梅噴霧劑藥物劑量低，緩解放療后口干效果明顯，噴霧劑型攜帶方便，居家易行，但其作用途徑的機制研究不足，難以在臨床上擴大使用。本研究結(jié)果提示烏梅噴霧劑可促進大鼠的唾液分泌，改變唾液成分，降低唾液腺細胞的病理損傷程度，但自噬機制及水通道蛋白是腺泡細胞水分泌的關(guān)鍵[17]，烏梅甘草合劑的給藥途徑區(qū)別研究還需進一步探索自噬及水通道蛋白作用的機制，亟待加強基礎(chǔ)研究，為烏梅甘草合劑在臨床上的使用劑型提供更充分的依據(jù)。

參考文獻：