攜帶3xflag 基因的重組水痘帶狀皰疹病毒的構(gòu)建

張 科，王立新，于 魁，張 放，李 冀，劉愛(ài)華，李淑英

(1. 華北理工大學(xué)，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063210；2. 唐山市豐潤(rùn)區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，唐山市豐潤(rùn)區(qū)食品監(jiān)督管理所，河北唐山 064000)

細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)的發(fā)展是病毒突變領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，為克隆大段DNA病毒提供了極大方便[1-3]。以GalK為基礎(chǔ)的選擇與反選構(gòu)建重組病毒，為病毒基因突變提供了便利方法[4]。3xflag標(biāo)記含22個(gè)氨基酸殘基，具有高度免疫靈敏性，通常位于融合蛋白的外表面，便于目的蛋白的檢測(cè)和純化；含有3xflag融合蛋白的檢測(cè)靈敏度高于其他系統(tǒng)[5-8]。本研究利用GalK為基礎(chǔ)的同源重組方法，將3xflag添加到水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)開放讀碼框(open reading frame, ORF)7，構(gòu)建攜帶3xflag基因的重組VZV。

1 材料與方法

1.1材料E.coliSW102菌株及其電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒GalK(pGalK)，質(zhì)粒3xflag(p3xflag)，野生型(wild type)VZV BAC DNA(VZVWTBAC)DNA，含有VZV全部基因組，熒光標(biāo)記及氯霉素抗性，均為美國(guó)羅格斯大學(xué)新澤西醫(yī)學(xué)院朱樺教授惠贈(zèng)。

1.2制備含有VZVWTBAC的SW102細(xì)胞將5 μg VZVWTBAC DNA電轉(zhuǎn)到50 μL SW102電感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1 mL LB培養(yǎng)液，32 ℃孵育1 h；離心，用1×M9液[4]洗滌沉淀2次，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基(含有12.5 mg/mL的氯霉素)，32 ℃培養(yǎng)1 d后有克隆形成，挑選4個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，用VZVWTORF7引物檢測(cè)(Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCG-

TGGATTTGGTTCAACTG-3′)。并將其命名為SW102-VZVWTBAC。制備SW102-VZVWTBAC電感受態(tài)細(xì)胞，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增帶有VZVORF7左右同源臂的GalKPCR擴(kuò)增GalK片段，反應(yīng)體系(100 μL)：1×PCR buffer，3.0 mmol/L MgCl2，10 μmol/L dNTPs，4 UTaqDNA聚合酶，引物10 μmol/L(Forward，5′-GA-ATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTT-CAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCC-TGTTGACAATTAATCATCGGCA-3′；Reverse，5′-GCTCTTCAGTTGGTATTCGAGCATATCCACATAAGCTGGCACACACCGTCTGTCAGCACT-GTCCTGCTCCTT-3′)，200 ng質(zhì)粒GalK DNA。PCR循環(huán)反應(yīng)如下：95 ℃ 15 min；然后31個(gè)循環(huán)95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1.5 min；延伸72 ℃ 10 min，20 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠純化。

1.4GalK基因插入VZVORF7將已純化帶有VZVORF7左右同源臂的GalK電轉(zhuǎn)到SW102-VZVWTBAC感受態(tài)細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到含有1 mL LB培養(yǎng)液，在32 ℃搖床孵育1 h，離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，取沉淀涂布于M63配制的GalK培養(yǎng)板[4]，32 ℃培養(yǎng)3 d后有克隆形成；挑選2個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(所用引物Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCGTGGATTTGGTTCAACTG-3′，產(chǎn)物1 400 bp)檢測(cè)GalK。將其命名為SW102-VZVORF7-GalK-BAC。制備其感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.53xflag代替GalK基因首先用帶有50 bp VZVORF7左右同源臂的3xflag引物Forward：5′-GAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAG-TTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATG-ATGGACTACAAAGACCATGAC-3′；Reverse：5′-GCTCTTCAGTTGGTATTCGAGCATATCCACA-TAAGCTGGCACACACCGTCTGCTTGTCATCG-TCATCCTTG-3′(產(chǎn)物大小為169 bp)；質(zhì)粒3xflag模板，PCR擴(kuò)增3xflag，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，回收純化。

取約800 ng已純化的VZVORF7-3xflag PCR產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)到 SW102-VZVORF7-GalK-BAC感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1 mL LB培養(yǎng)液，32 ℃振搖4.5 h，離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，將沉淀混懸于1 mL M9培養(yǎng)液中，再分別進(jìn)行10倍及100倍稀釋后涂布于M63配制[4]脫GalK培養(yǎng)板，32 ℃培養(yǎng)3 d，有克隆形成；挑選4個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(所用引物Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCGTGGATTTGGTTCAACTG-3′；產(chǎn)物859 bp)。將其正確克隆命名為SW102-VZVORF7-3xflag-BAC。

1.6轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞接種于6孔反應(yīng)板，置于37 ℃，50 mL/L CO2溫箱中培養(yǎng)，待其匯合度生長(zhǎng)為60%時(shí)，分別用SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：分別取4.5 μg SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC質(zhì)粒置于2個(gè)1.5 mL EP管中(做好標(biāo)記)，用無(wú)血清的DMEM稀釋至150 μL。取18 μL轉(zhuǎn)染試劑，用無(wú)血清的DMEM稀釋至300 μL。平均分裝到上述2個(gè)EP管中，混合均勻，室溫放置20 min。將上述SW102-VZVWTBAC的混合物添加到6孔板(分別標(biāo)記1、2、3、4、5、6)的第1、2孔，第3、4孔添加SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC混合物，第5、6孔作為對(duì)照。24 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液；然后每2～3 d換液；顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。待細(xì)胞長(zhǎng)滿6孔板后，轉(zhuǎn)移到10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，繼續(xù)觀察。

1.7轉(zhuǎn)染細(xì)胞中3xflag的表達(dá)待10 cm培養(yǎng)皿細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，分別提取細(xì)胞RNA及蛋白，用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot檢測(cè)3xflag的表達(dá)狀況。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增檢測(cè)SW102-VZVWTBAC將所選克隆提取質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到產(chǎn)物大小為869 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相一致，說(shuō)明所選克隆是正確的，將其命名為SW102-VZVWTBAC。

圖1 VZVWTBAC電轉(zhuǎn)到SW102所選克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of PCR amplified for verification of VZVWTBAC cloned to SW102

2.2GalK插入VZVORF7GalK培養(yǎng)板篩選3 d后，將所選克隆提取質(zhì)粒DNA，電泳檢測(cè)到約1 589 bp的產(chǎn)物(圖2)，所得片段大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明GalK已克隆至VZVORF7。將其命名為SW102-VZVORF7-GalK-BAC。

圖2 GalK電轉(zhuǎn)到 SW102-VZVWTBAC所選克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of PCR amplification for verification of GalK electroporated to SW102-VZVWTBAC

2.33xflag替代GalK基因從脫GalK平板所選擇的2個(gè)克隆，檢測(cè)到大約859 bp的產(chǎn)物(圖3)，所得片段大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明3xflag已克隆至VZVORF7。將其命名為SW102-VZVORF7-3xflag-BAC。

2.4轉(zhuǎn)染結(jié)果分別將 SW102-VZVWTBAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察顯示：3 d后可見帶有綠色熒光的病毒斑塊，15～20 d帶有綠色熒光的病毒越來(lái)越多(圖4)。將重組病毒命名為VZVORF7-3xflag。

圖3 3xflag 電轉(zhuǎn)至SW102-VZVORF7-GalK-BAC后所選克隆及轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VZVWTBAC與VZVORF7-3xflag-BAC的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis results of PCR products for verification of 3xflag from the selected clones of electroporated to SW102-VZVORF7-GalK-BAC, and verification of VZVWTBAC and VZVORF7-3xflag-BAC from VZVWTBAC and VZVORF7-3xflag-BAC transfected ARPE-19 cells

圖4 熒光顯微鏡觀察SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況Fig.4 Growing virus after SW102-VZVWTBAC and SW102-VZVORF7-3xflag-BAC transfected to ARPE-19

2.5VZVORF7-3xflag的表達(dá)情況將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)大約20 d收集細(xì)胞，分別提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞RNA和蛋白，逆轉(zhuǎn)錄和Western blot檢測(cè)3xflag表達(dá)狀況，逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物約859 bp和948 bp，分別為SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC DNA轉(zhuǎn)染結(jié)果(圖3)；Western blot用抗ORF7鼠單克隆抗體檢測(cè)SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到大約29 ku和30 ku蛋白(圖5A)。flag表達(dá)系統(tǒng)是8個(gè)氨基酸組成的親水性肽。flag肽位于融合蛋白的表面。3xflag系統(tǒng)是通過(guò)融合3個(gè)串聯(lián)flag表位(22個(gè)氨基酸)對(duì)原始系統(tǒng)的改進(jìn)，當(dāng)與抗flag抗體結(jié)合時(shí)，1個(gè)抗體結(jié)合1個(gè)flag表位得到約1 ku條帶，2個(gè)抗體結(jié)合2個(gè)flag表位得到約2 ku條帶，2個(gè)抗體結(jié)合2個(gè)flag表位得到約3 ku條帶。因此，用抗flag鼠單克隆抗體檢測(cè)SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞得到大約1、2、3 ku蛋白(圖5B)。

圖5 Western blot檢測(cè)VZVWT和VZV ORF7-3xflag感染ARPE-19細(xì)胞中ORF7及flag的表達(dá)狀況Fig.5 Detection ORF7 and flag from VZVWT and VZV ORF7-3xflag infected ARPE-19 cells by Western blot

3 討 論

實(shí)驗(yàn)誘變方法的進(jìn)步為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)病機(jī)制、生物工程、疫苗的開發(fā)等提供了極大的方便[9-12]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)突變方法包括：插入突變、位點(diǎn)定向誘變及轉(zhuǎn)座子突變等。這些傳統(tǒng)的突變方法涉及到分子克隆所依賴的載體準(zhǔn)備、待插入的DNA片段及連接等過(guò)程。用這些傳統(tǒng)方法進(jìn)行突變的程序不僅浪費(fèi)了大量的時(shí)間，而且消耗了大量的體力勞動(dòng)。

細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆技術(shù)在病毒突變方面是一項(xiàng)重大突破，這種技術(shù)克服了傳統(tǒng)突變方法的缺點(diǎn)。病毒BAC克隆的病毒可在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)保持穩(wěn)定及傳播，可容易地進(jìn)行病毒基因組的操作，任何要求的病毒基因突變都可容易地利用病毒BAC克隆而取得。這種突變還可以在獲得重組病毒之前加以驗(yàn)證。這種新方法對(duì)于重組病毒的結(jié)構(gòu)及功能的研究提供了極大的方便[1,13-15]。

同源重組是基因重組的一種類型，是2個(gè)相同序列的DNA核苷酸之間進(jìn)行交換。野生型大腸桿菌對(duì)誘導(dǎo)外源DNA的同源重組是無(wú)效的，因?yàn)榫€性DNA通常被RecBCD核酸外切酶降解。SW102菌株包含1個(gè)溫度敏感的λ噬菌體編碼的1個(gè)暫時(shí)抑制RecBCD(gam)的基因，以及2個(gè)基因(exo和beta)在同源重組過(guò)程中進(jìn)行雙鏈的損傷修復(fù)[15]。λ噬菌體對(duì)溫度敏感(由于1個(gè)溫度敏感λcI抑制子的表達(dá))，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)溫度從32 ℃增加到42 ℃時(shí)，線性DNA的攝取和重組可以在幾分鐘內(nèi)完成[15]。這樣，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞在32 ℃正常生長(zhǎng)時(shí)，可以有幾千個(gè)堿基對(duì)進(jìn)行同源重組。另外，改良的溫度敏感的λ噬菌體要求的同源重組發(fā)生在同源序列相對(duì)較窄的一個(gè)區(qū)域內(nèi)，因?yàn)锽AC突變體的建立通常是使用PCR擴(kuò)增的基因序列，其兩側(cè)應(yīng)為約40個(gè)堿基對(duì)與病毒DNA BAC序列同源[3]。

為進(jìn)一步探討GalK為基礎(chǔ)的基因重組突變方法，本實(shí)驗(yàn)將3xflag作為融合表達(dá)目標(biāo)蛋白添加到VZV ORF7構(gòu)建重組病毒的方法，結(jié)果顯示：使用flag作為標(biāo)簽，與靶蛋白ORF7融合表達(dá)具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，flag通常不與靶蛋白ORF7相互作用，也不影響ORF7的功能或性質(zhì)；因此，可以通過(guò)融合蛋白探討靶蛋白ORF7的功能；第二，flag融合靶蛋白可以非變性純化，有效純化活性融合蛋白。第三，flag標(biāo)簽蛋白可以被抗flag抗體識(shí)別，并且容易通過(guò)Western印跡方法檢測(cè)或鑒定。將3xflag與ORF7融合表達(dá)，可以有效地增強(qiáng)ORF7的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探討ORF7功能研究奠定基礎(chǔ)；同時(shí)利用細(xì)菌人工人染色體作為載體，通過(guò)GalK選擇，反向選擇及同源重組方法，構(gòu)建了攜帶3xflag基因的重組VZV，表明通過(guò)GalK為基礎(chǔ)的同源重組，可方便、快捷并準(zhǔn)確地對(duì)感興趣的病毒基因進(jìn)行操作。

參考文獻(xiàn)：

[1] WARDEN C, TANG Q, ZHU H. Herpes virus BACs: Past, present, and future[J]. J Biomed Biotechnol, 2011, 2011:124595.

[2] ZHANG Z, HUANG Y, ZHU H. A highly efficient protocol of generating and analyzing VZV ORF deletion mutants based on a newly developed luciferase VZV BAC system[J]. J Virol Methods, 2008, 148(1-2):197-204.

[3] LEE EC, YU D, MARTINEZ DE VELASCO J, et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA[J]. Genomics, 2001, 73(1):56-65.

[4] TANG Q, SILVER B, ZHU H. Protocol of a seamless recombination with specific selection cassette in PCR-based site-directed mutagenesis[M]//NAIK G. Applied biological engineering-principles and practice. Rijeka: Intech, 2012, 461-478.

[5] FUJITA T, FUJII H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins[J]. BMC Mol Biol, 2014, 15:26.

[6] RICCI V, BLAIR JM, PIDDOCK LJ. RamA, which controls expression of the MDR efflux pump AcrAB-TolC, is regulated by the Lon protease[J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(3):643-650.

[7] STEAD CM, OMSLAND A, BEARE PA, et al. Sec-mediated secretion by Coxiella burnetii[J]. BMC Microbiol, 2013, 13:222.

[8] CHAPDELAINE P, GERARD C, SABCHEZ N, et al. Development of an AAV9 coding for a 3XFLAG-TALEfrat#8-VP64 able to increase in vivo the human frataxin in YG8R mice[J]. Gene Ther, 2016, 23(7):606-614.

[9] CAMILO CM, LIMA GM, MALUF FV, et al. HTP-OligoDesigner: An online primer design tool for high-throughput gene cloning and site-directed mutagenesis[J]. J Comput Biol, 2016, 23(1):27-29.

[10] DOGRULUK T, TSANG YH, ESPITIA M, et al. Identification of variant-specific functions of PIK3CA by rapid phenotyping of rare mutations[J]. Cancer Res, 2015, 75(24):5341-5354.

[11] CHAVALI S, MAHAJAN A, GHOSH S, et al. Protein molecular function influences mutation rates in human genetic diseases with allelic heterogeneity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 412(4):716-722.

[12] MOLINSKI SV, AHMADI S, HUNG M, et al. Facilitating structure-function studies of CFTR modulator sites with efficiencies in mutagenesis and functional screening[J]. J Biomol Screen, 2015, 20(10):1204-1217.

[13] DAI G, KIM S, O’CALLAGHAN DJ, et al. Development of a bacterial artificial chromosome (BAC) recombineering procedure using GalK-untranslated region (UTR) for the mutation of diploid genes[J]. J Virol Methods, 2012, 182(1-2):18-26.

[14] BISWAS K, STAUFFER S, SHARAN SK. Using recombineering to generate point mutations: GalK-based positive-negative selection method[J]. Methods Mol Biol, 2012, 852:121-131.

[15] YU D, ELLIS HM, LEE EC, et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(11):5978-5983.