硒元素及硒蛋白在糖尿病腎病中的表達(dá)變化

黃芙萌，趙 莉，程麗榮，陳 釗，付榮國(guó)，田李芳

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，陜西西安 710004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者重要的死亡原因。DN已經(jīng)成為全球性公共健康問(wèn)題，其患病率和病死率高，患者長(zhǎng)期治療會(huì)產(chǎn)生巨額的醫(yī)療費(fèi)用。

腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells, MCs)是最活躍的固有細(xì)胞，其主要作用為維持腎小球微血管床的結(jié)構(gòu)完整性及系膜基質(zhì)平衡狀態(tài)。在代謝性腎小球疾病如DN中，MCs是主要受到攻擊的目標(biāo)[1]。在DN諸多發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是重要的共同機(jī)制[2]。糖尿病患者M(jìn)Cs產(chǎn)生的活性氧增多，抗氧化物質(zhì)減少，糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)促使脂質(zhì)過(guò)氧化，最終激活關(guān)鍵因子TGF-β，使MCs凋亡、表型轉(zhuǎn)分化、肥大、增生或產(chǎn)生過(guò)多的生長(zhǎng)因子、趨化因子及細(xì)胞因子等病理性改變，促進(jìn)了腎小球硬化和DN的發(fā)生發(fā)展。

因此，MCs在高糖作用下如何對(duì)抗氧化應(yīng)激以延緩DN的發(fā)生發(fā)展成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)，硒蛋白通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激對(duì)MCs的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。硒蛋白指組成中含有硒代半胱氨酸(Sec)的蛋白質(zhì)。人類(lèi)已發(fā)現(xiàn)的硒蛋白基因有25種，翻譯超過(guò)30種硒蛋白，發(fā)揮著抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及產(chǎn)生活性甲狀腺素等多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究將探究在DN患者體內(nèi)是否存在低硒狀態(tài)、這種低硒狀態(tài)與患者哪些臨床指標(biāo)相關(guān)、高糖環(huán)境時(shí)人MCs中哪些硒蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化，為闡明低硒敏感的硒蛋白在MCs病理變化及DN發(fā)生發(fā)展中的作用提供臨床和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑人腎小球系膜細(xì)胞系(HMCs)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。D-葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，PCR primers由北京三博志遠(yuǎn)公司合成，SYBR Green qPCR Mix及RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自加拿大Roche公司，1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，MTT及DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀(BIO-RAD公司)，6孔板及96孔板(美國(guó)Corning公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)，CE2301微量核酸蛋白定量?jī)x(英國(guó)Cecil公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1研究對(duì)象 研究對(duì)象為本科室收治的DN患者。對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：所選患者條件均符合DN的診斷標(biāo)準(zhǔn)，尚未進(jìn)入血液凈化治療且年齡大于18歲的成年人，排除其他原因?qū)е碌哪I臟損傷患者，排除正在使用激素或者免疫抑制劑治療的患者，排除合并其他重要疾病的患者。研究對(duì)象中對(duì)DN的疾病分期未要求，包括處于各期的DN患者。正常對(duì)照組取自體檢中心的健康體檢人員。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)并符合倫理學(xué)要求。收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括年齡、性別、血常規(guī)、肝功能、腎功能、血脂及糖化血紅蛋白水平。

1.2.2樣品處理及硒元素測(cè)定 早晨空腹肘部淺靜脈抽取血液3 mL，部分研究對(duì)象直接留取全血，余血液在EDTA抗凝管內(nèi)3 000 r/min離心10 min，分離血漿，分裝后-20 ℃冰箱保存。樣本收集好后送陜西省西安市微量元素研究所，采用180/80偏振zecman原子吸收光譜儀測(cè)定全血和血漿中的硒含量。

1.2.3細(xì)胞活性檢測(cè) HMCs細(xì)胞種于96孔板中，每孔6 000個(gè)。在含有100 mL/L胎牛血清及2%青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)24 h貼壁后，換為含正常糖(11.1 mmol/L D-葡萄糖)或高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)的1640培養(yǎng)基刺激分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。將3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)溶液(0.5 mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液中)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37 ℃誘導(dǎo)4 h。隨后，吸出培養(yǎng)基并加入DMSO 150 μL以溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度并通過(guò)與對(duì)照組比較來(lái)計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)硒蛋白基因表達(dá) 100 mL/L胎牛血清及2%青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HMCs細(xì)胞，用正常糖(11.1 mmol/L D-葡萄糖)和高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)分別刺激培養(yǎng)細(xì)胞24 h，洗滌細(xì)胞后Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA。RT-qPCR法檢測(cè)人23種硒蛋白的mRNA表達(dá)水平。室溫下建立PCR反應(yīng)體系10 μL，包含0.5 μg反轉(zhuǎn)好的cDNA為模板。反應(yīng)程序?yàn)椋撼跏甲冃?95 ℃ 30 s)；40個(gè)循環(huán)變性(95 ℃ 5 s)，退火(60 ℃ 15 s)，延伸(72 ℃ 30 s)；最后延伸(72 ℃ 30 s)。基因相對(duì)表達(dá)量使用2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1DN患者全血及血漿中硒含量顯著降低收集了17例正常對(duì)照及37例DN患者的血漿，其中9例正常對(duì)照及9例DN患者的全血，分別檢測(cè)了元素硒的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DN患者血漿中的硒含量顯著降低(P<0.000 1)，DN患者全血中的硒含量也顯著降低(P<0.001，圖1)。

圖1 對(duì)照組和DN組患者血漿及全血中硒含量的比較Fig.1 Comparison of selenium contents in the plasma and whole blood between DN patients and healthy controls

2.2DN患者硒含量與血糖水平及腎功能顯著相關(guān)正常對(duì)照及DN患者的臨床資料統(tǒng)計(jì)分析如表1所示，

與對(duì)照組相比，DN患者組年齡大(P<0.01)、腎功能差(P<0.000 1)、血漿總蛋白(P<0.05)及白蛋白(P<0.01)水平低，貧血、糖化血紅蛋白水平均顯著升高(P<0.000 1)，而血脂水平與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 研究對(duì)象的基本資料Tab.1 Basic clinical information of the study subjects

DN患者血漿中硒含量與臨床指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系如表2所示。患者血漿硒含量水平與血尿素氮及血肌酐水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.368和-0.413，即DN患者中腎功能越差，其血漿硒含量水平越低；血漿硒含量水平與糖化血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.400)，即DN患者血紅蛋白水平越高，其血漿硒含量越低。血漿硒含量與血漿總蛋白、白蛋白、血脂水平及血紅蛋白間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

其他臨床指標(biāo)間的相關(guān)分析還顯示：DN患者的尿素氮及糖化血紅蛋白水平與年齡呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.285和0.490?；颊吣蛩氐脚c血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467)，與糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)(r=0.538)。

表2 DN患者血漿中硒含量及臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation between plasma selenium content and clinical indicators (r)

2.3高糖刺激HMCs細(xì)胞硒蛋白表達(dá)譜的變化MTT法測(cè)定高糖刺激下不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的活力，篩選出高糖刺激HMCs增殖的最佳時(shí)間點(diǎn)。分別給予高糖刺激1、2、3、4 d后檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，高糖刺激1 d后細(xì)胞活力已明顯升高(圖2)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞活力并未再出現(xiàn)明顯升高。因此，我們選擇高糖刺激24 h來(lái)觀察硒蛋白表達(dá)譜的變化。

圖2 高糖刺激HMCs細(xì)胞的增殖情況Fig.2 Proliferation of HMCs stimulated by high glucose

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)所使用的21種硒蛋白引物如表3所示。檢測(cè)HMCs所表達(dá)的21種硒蛋白在高糖條件下的mRNA水平表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖組Gpx1、TrxR2、TrxR3、Dio2、Dio3、SelK、SelN、SelP、SelR、SelT、SelW、SPS2的表達(dá)均顯著性減低(P<0.05)，初步篩選出了有表達(dá)差異的硒蛋白(圖3)。

3 討 論

硒與腎臟疾病的關(guān)系密不可分[3]，在急性腎損傷或慢性腎臟病患者中，血漿中的低硒狀態(tài)被一系列研究所證實(shí)，尤其是在透析患者中[4-8]。本研究結(jié)果顯示，DN患者血漿及全血中的硒含量與正常對(duì)照相比有顯著性下降，且腎功能越差，糖化血紅蛋白水平越高，其體內(nèi)硒含量越低。在腎臟疾病中，這種硒缺乏HMCs在正常糖或高糖條件下培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)硒蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=3)，相對(duì)于對(duì)照組，*P<0.05。NG：正常糖濃度(11.1 mmol/L)；HG：高糖濃度(30 mmol/L)。

表3 人硒蛋白PCR引物信息Tab.3 PCR primer sequences of human selenoproteins

圖3 高糖刺激下人腎小球系膜細(xì)胞中硒蛋白的表達(dá)變化Fig.3 Changes of selenoprotein expressions in HMCs stimulated by high glucose

狀態(tài)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、免疫功能及甲狀腺激素合成等途徑參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。在一些動(dòng)物模型的補(bǔ)硒實(shí)驗(yàn)中，也多次驗(yàn)證了硒對(duì)腎臟的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用[10-12]。

然而，硒是人類(lèi)健康的一把雙刃劍[13]。一系列研究表明，過(guò)度補(bǔ)硒會(huì)降低細(xì)胞間氧化應(yīng)激水平，干擾胰島素的合成及分泌，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖和脂質(zhì)代謝紊亂[14]。與安慰劑組相比，給2型糖尿病患者補(bǔ)硒會(huì)增加其空腹血糖、糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白水平[15]。本研究中血漿硒含量與糖化血紅蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明患者體內(nèi)是明顯的低硒狀態(tài)。如何科學(xué)地利用好硒及硒蛋白而避免其不必要的副作用，這要求我們深入地研究硒及硒蛋白的代謝機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，在高糖刺激下，人MCs中Gpx1、TrxR2、TrxR3、Dio2、Dio3、SelK、SelN、SelP、SelR、SelT、SelW、SPS2的表達(dá)顯著性減低。硒缺乏時(shí)，機(jī)體傾向于僅表達(dá)必需硒蛋白[16]，不是所有組織都能平等地得到有限的硒元素，例如甲狀腺和大腦會(huì)優(yōu)先得到硒蛋白的補(bǔ)充，這就是所謂硒蛋白表達(dá)的等級(jí)制度[17]。硒元素在體內(nèi)發(fā)揮作用的載體是硒代半胱氨酸(Sec)，Sec由密碼子UGA介導(dǎo)的翻譯參入，參與構(gòu)成硒蛋白的活性中心，復(fù)雜的Sec插入過(guò)程是硒蛋白體內(nèi)合成的關(guān)鍵，其中任何因素變化將導(dǎo)致硒蛋白不同剪接體的形成[16]，即含有Sec的有硒酶活性的全長(zhǎng)硒蛋白、Sec缺失的無(wú)硒酶活性的截短硒蛋白。那么在DN患者體內(nèi)，這些對(duì)硒元素敏感變化的硒蛋白會(huì)對(duì)MCs產(chǎn)生什么樣的作用，是否加速了DN的進(jìn)展，是否通過(guò)其截短體來(lái)實(shí)現(xiàn)促M(fèi)Cs病理變化的作用，從而加速了DN的進(jìn)展，在高糖刺激的人MCs細(xì)胞中，補(bǔ)硒或者補(bǔ)充哪一種硒蛋白能延緩DN的進(jìn)展，這都需要進(jìn)一步研究。

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