白藜蘆醇通過TGF-β1/Smad3信號通路抑制心肌成纖維細胞中AngⅡ誘導的 Ⅰ/Ⅲ 型膠原合成

卓小楨，劉 懿，李 娜，尹晶晶，習 文，劉軍輝,

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院：1. 心血管內(nèi)科；2. 檢驗科，陜西西安 710061)

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)可由多種疾病導致，其基本的病理變化是心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts, CFs)的過量增殖，同時伴有細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM)過量積聚，不斷發(fā)展可導致心臟結(jié)構的改變，心臟順應性下降和舒縮功能減低。常見的心肌纖維化原發(fā)病有高血壓、糖尿病、心肌梗死、擴張性心肌病等。長期慢性的高血壓損傷可不斷重構心臟原本健康高效的組織結(jié)構，而CFs的增生和ECM增多是大多數(shù)纖維化的具體病理表現(xiàn)[1]。形成高血壓相關MF的機制較為復雜，和多種細胞生長因子和炎癥因子的調(diào)控相關[2]。在高血壓MF形成過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)的表達和分泌明顯增多[3]。TGF-β的增加可促進與膠原相關的多種基因的表達，相關CFs被激活，使得膠原分泌量增多，進而導致心肌ECM合成、沉積增加。TGF-β通過提高Smads蛋白的磷酸化水平而完成相關信號通路的激活，將信號傳導至細胞核內(nèi)完成其相應的生物學效應[4-6]。這一信號通路與MF有著密切的關系，其信號通路的異常活化可導致多種器官的纖維化進程。

白藜蘆醇(resveratrol, Res)化學名為3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯，是一種天然的含有芪類結(jié)構的非黃酮類多酚類化合物，主要存在于葡萄和虎杖等植物的莖及種子中[7]。Res具有多種生物活性，在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Res可抑制TNF-α、IL-6和TGF-β等因子在肺纖維化中的表達，并降低炎癥介質(zhì)的水平，緩解損傷，抑制間質(zhì)纖維化，減少細胞外基質(zhì)沉積，保護肺組織[9]。在心血管系統(tǒng)中，Res不但能夠降低血糖，還可以減少心臟缺血和再灌注損傷所誘導的心肌梗死范圍，在此基礎上提高部分心室的功能；體外實驗發(fā)現(xiàn)，Res可抑制由血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)誘導的離體心肌細胞肥大[10]。這都提示Res在抗心肌纖維化中可能扮演著的重要角色。但是，關于Res在高血壓導致的心肌纖維化過程中起什么樣的作用，這一過程是否有TGF-β/Smads通路的參與等問題，目前尚未明確。本研究以CFs為實驗對象，研究Res對高血壓誘導的MF的抑制效果， 探討TGF-β/Smads信號通路在Res抗纖維化過程中的作用，闡明其可能的分子機制，為尋找心肌纖維化新的治療靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞鑒定與培養(yǎng)以Langendorf法逆行灌注急性酶解分離Wistar大鼠(3～5周齡)CFs[11]，用免疫熒光化學染色法驗證分離的細胞中是否存在vimentin抗原的表達，通過細胞形態(tài)學和細胞中vimentin抗原的存在與否來鑒定分離的細胞是否為CFs。以分離培養(yǎng)的第2～8代CFs為研究對象，采用DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基+2 μmol/L AngⅡ、DMEM培養(yǎng)基+2 μmol/L AngⅡ+50 μmol/L Res不同條件干預，測定相關指標。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，含100 mL/L胎牛血清(美國Hyclone公司)；100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(美國Sigma公司)；白藜蘆醇、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Ⅰ型膠原抗體(ab90395)和Ⅲ型膠原抗體(ab7778)購自英國Abcam公司；Smad-3抗體(9513s)和P-Smad-3抗體(ser423/425)(9520s)均購自美國CST公司；TGF-β1抗體(sc-31609)，β-actin (sc-47778)購自美國Santa Cruz生物科技公司。

1.3Real-timePCR檢測CFs中Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ)及TGF-β1mRNA的表達

RNA fast200(上海飛捷，中國)試劑盒提取CFs中總RNA，使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，中國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板通過SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，中國)進行Real-time PCR反應。PCR反應條件及過程：預變性94 ℃ 4 min；單次循環(huán)的條件及過程：變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，以β-actin作為對照，用比較Ct法分析基因表達的相對變化。相關引物序列信息見表1。所有操作按照說明書進行。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4Westernblot技術檢測CFs中不同蛋白的表達使用RIPA裂解液(碧云天，中國)提取細胞總蛋白，BCA試劑盒(碧云天，中國)測定蛋白總濃度；細胞蛋白在100 g/L SDS-PAGE凝膠上進行電泳，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉阻斷后，用一抗對膜進行免疫印跡，4 ℃靜置過夜，在室溫下將膜與HRP標記的二抗雜交1 h，用增強化學發(fā)光法測定蛋白表達；使用Image-J軟件分析目的條帶的累積灰度值，并與內(nèi)參β-actin比較。所有操作按照說明書進行。

1.5ELISA法檢測CFs培養(yǎng)液上清中可溶性CollagenⅠ和TGF-β1蛋白水平取細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min，取上清。所有操作按照說明書進行。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次及以上。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩兩比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1CFs的形態(tài)特征及鑒定光鏡下可見細胞排列緊密，有的交叉重疊生長。與心肌細胞不同，CFs呈梭形，胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，通常含2～3個核，無自發(fā)性搏動(圖1)。免疫熒光染色鏡下可見，細胞質(zhì)內(nèi)有紅色細熒光顆粒染色的陽性信號，細胞核染色為天藍色，表明胞質(zhì)內(nèi)vimentin抗原表達明顯，證明實驗所獲得的細胞就是CFs(圖2)。

圖1 CFs的形態(tài)Fig.1 Morphology of myocardial fibroblasts (×200)

圖2 CFs中vimentin抗原的表達情況Fig.2 Expression of vimentin in myocardial fibroblasts (×200)

2.2Res抑制CFs中AngⅡ誘導的膠原產(chǎn)生采用Real-time PCR檢測AngⅡ及Res對Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達的影響，結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ干預顯著促進CFs中Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(P<0.05)，Res顯著抑制AngⅡ誘導的Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(P<0.05，圖3A)。提示Res抑制了AngⅡ誘導的Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的轉(zhuǎn)錄。免疫印跡方法檢測AngⅡ及Res對Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ顯著促進CFs中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(P<0.05)，Res顯著抑制AngⅡ誘導的Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(P<0.05，圖3B)。由于膠原蛋白屬于分泌型蛋白，合成后將轉(zhuǎn)運至細胞外參與細胞外基質(zhì)的構成，為此進一步檢測了培養(yǎng)基中Ⅰ型膠原蛋白濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ的干預可以顯著提高培養(yǎng)基中的Ⅰ型膠原水平(P<0.05)，在加入了Res后AngⅡ?qū)Β裥湍z原的誘導作用被明顯抑制(P<0.05，圖3C)。

圖3 Res抑制CFs中AngⅡ誘導的膠原產(chǎn)生Fig.3 Res inhibited AngⅡ-induced collagen produc-tion in CFs

2.3Res抑制CFs中AngⅡ誘導的TGF-β1表達和Smad-3的磷酸化采用Real-time PCR檢測AngⅡ及Res對TGF-β1 mRNA表達的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ顯著促進CFs中TGF-β1 mRNA表達(P<0.05)，Res顯著抑制AngⅡ誘導的TGF-β1 mRNA表達(P<0.05，圖4A)。免疫印跡方法檢測AngⅡ及Res對TGF-β1蛋白表達和Smad-3磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ干預顯著促進CFs中TGF-β1蛋白表達(P<0.05)，Res顯著抑制AngⅡ誘導的TGF-β1蛋白表達(P<0.05)；與對照組比較，AngⅡ干預顯著促進CFs中Smad-3磷酸化水平(P<0.05)，Res顯著抑制AngⅡ誘導的Smad-3磷酸化(P<0.05)；各種干預對Smad-3蛋白表達水平無顯著影響(圖4C)。采用ELISA方法檢測培養(yǎng)基上清中TGF-β1的含量，分析AngⅡ及Res對其分泌水平的影響。結(jié)果顯示，AngⅡ干預組培養(yǎng)基上清中TGF-β1含量顯著高于對照組(P<0.05)，于AngⅡ干預組中加入Res，TGF-β1含量較高AngⅡ干預組明顯降低(P<0.05，圖4B)。

3 討 論

高血壓是引發(fā)MF主要原因之一。在高血壓相關MF發(fā)生的同時會造成不同程度的交感神經(jīng)興奮，從而促進體內(nèi)AngⅡ的合成與分泌，AngⅡ可直接誘導CFs的增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。AngⅡ和醛固酮同時作用于CFs可呈協(xié)同效應，即聯(lián)合作用強于AngⅡ和醛固酮單獨促心肌纖維化作用[12]。為了探究Res在以上病理過程中的意義，本研究用AngⅡ干預CFs，發(fā)現(xiàn)其可以顯著促進CFs中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達；在培養(yǎng)基中加入Res，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了AngⅡ誘導的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達；同時，Res可以逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導的Ⅰ型膠原蛋白分泌的增多。提示Res在轉(zhuǎn)錄水平抑制了AngⅡ誘導的Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達，最終導致了Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達和分泌水平的變化。

圖4 Res抑制CFs中AngⅡ誘導的TGF-β1表達和Smad-3的磷酸化Fig.4 Res inhibited AngⅡ-induced TGF-β1 expression and Smad-3 phosphorylation in CFs

在高血壓MF形成過程中，TGF-β是與高血壓MF的形成關系最密切的細胞因子之一。TGF-β/Smads信號通路與MF有著密切的關系，其異常活化參與了人類多種臟器纖維化的發(fā)病過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CFs中，Res可以明顯抑制AngⅡ誘導的TGF-β1 mRNA和蛋白表達及分泌水平的增加。TGF-β/Smads信號傳導途徑最終是靠Smads的磷酸化實現(xiàn)對下游蛋白表達及功能的調(diào)控。為了進一步探討Res對TGF-β/Smads通路的具體作用，實驗同步檢測了Smad-3的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)Res顯著抑制AngⅡ誘導的Smad-3磷酸化，而對Smad-3蛋白表達水平無顯著影響。有研究表明，Res減緩纖維化的機制可能為減少氧化應激、降低炎癥因子表達、激活Sirt1從而抑制Smad3乙?；痆14]。另有報道，在各種體內(nèi)外試驗的病理環(huán)境和細胞類型中，TGF-β1表達上調(diào)和激活是AngⅡ誘導的纖維化反應的主要原因之一[15]，而通過AngⅡ特異性拮抗劑或AngⅡ受體阻滯劑干預阻斷AngⅡ的功能可以抑制TGF-β1的表達，從而預防心肌纖維化的發(fā)生[16]。越來越多的證據(jù)表明，AngⅡ不僅通過其在高血壓中的作用，而且可以直接影響CFs的增殖和活化而促進心臟重塑[17]。

以上結(jié)果表明，Res可以抑制CFs中AngⅡ激活的纖維化過程，而這一過程是和TGF-β1/Smad3通路直接相關的，不但可以直接抑制TGF-β1的mRNA及蛋白的表達，而且可以影響Smad3蛋白的磷酸化水平從而達到最終效果?？傊狙芯拷Y(jié)果證實，在AngⅡ介導的心肌纖維化過程中，TGF-β1/Smad3信號具有舉足輕重的作用。

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