MiR-106a作用于TIMP2誘導人胃癌BGC-823細胞的腹腔種植轉移

朱 萌，潘小麗，張 寧，和水祥，任牡丹

(1. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內科，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏銀川 750004；3. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710061)

胃癌在亞洲國家的發(fā)病率和死亡率一直居高不下[1]。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，尤以西北地區(qū)為著。西北地區(qū)胃癌早期發(fā)現率低，多數患者就診時已處于進展期并伴有多種類型轉移的發(fā)生，治療效果差，其中占轉移類型50%的腹腔種植轉移是導致患者死亡、復發(fā)、預后差的不可忽略因素[2-3]。一旦發(fā)生腹腔種植轉移，就不易被切除干凈，術后極易復發(fā)，增加了腫瘤細胞的侵襲性和惡性腫瘤對人體的危害性[4]。研究表明，miRNA在腫瘤轉移的多個環(huán)節(jié)包括黏附、滾動、細胞外基質的降解等方面起到關鍵調節(jié)作用[5]，但關于miR-106a與胃癌腹腔種植轉移關系仍知之甚少。基于此，本課題在體外水平觀察miR-106a與胃癌細胞侵襲轉移的關系，進一步在體內水平有針對性地研究miR-106a與種植轉移的關系，并結合基質金屬蛋白酶抑制物TIMP2探討miR-106a誘導人胃癌細胞腹腔種植轉移的可能機制，以期為胃癌的臨床診治提供一定的實驗依據和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1主要材料人胃低分化腺癌BGC-823細胞株(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)；PRMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清、RIPA裂解液(杭州四季青公司)，EDTA-胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；RNA提取試劑盒(貨號：5080576001，德國Roche公司)；Real-time PCR引物及試劑盒(miR-106a ID：002169，U6 snRNA ID：001973，美國Life technology公司)；Transwell小室(美國Millipore公司)；MiR-106a拮抗劑(hsa-miR-106a-5p antagomir，miR30000103-1-10)和無關序列陰性對照(microRNA negative control #24，miR-NC，廣州銳博公司)；BALB/c裸鼠[SCXK(京)2012-0001，北京維通利華實驗動物技術有限公司]；兔多克隆TIMP2抗體(17353-1-AP，美國proteintech公司)；通用二步法檢測試劑盒(PV-9000，北京中杉金橋公司)；ECL化學發(fā)光試劑(美國Millipore公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及轉染人胃癌BGC-823細胞株，采用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時傳代培養(yǎng)至對數生長期。轉染前1 d，按2×105個細胞/孔接種至6孔培養(yǎng)板，使轉染時細胞密度達到50%～70%。次日miR-106a antagomir和negative control優(yōu)化濃度200 nmol/L直接轉染，轉染后48 h消化細胞，使用Roche High Pure miRNA Isolation Kit抽提小RNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，遵循無菌無酶操作規(guī)范，抽提出的小RNA分子進行質量檢測，A在1.8～2.0之間表示RNA純度完好。

1.3Real-timePCR采用Taqman探針法進行real-time PCR(qRT-PCR)反應，標化內參U6 snRNA基因。RNA模板量10 ng，配制反應混合液，置于Bio-Rad S1000 PCR儀上逆轉錄，反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min、4 ℃終止。cDNA模板與擴增反應混合液混勻，于Bio-Rad C1000 PCR儀上擴增，反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。結果采用2-△△Ct計算相對基因表達量，Ct=目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環(huán)數。

1.4Transwell實驗細胞分3組：BGC-823、BGC-823/anti-miR-106a，BGC-823/negative control。轉染前一天取對數生長期細胞以2×105個/孔、100 μL/孔接種于6孔培養(yǎng)板，48 h后消化離心收集細胞，transwell下室加入600 μL含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，上室按2×104個細胞/100 μL/室滴加細胞懸液。每組3個小室。侵襲試驗將Matrigel基質膠按1∶5比例稀釋50 μL/孔加入上室。溫箱培養(yǎng)24 h后，40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min，1 g/L結晶紫染色10 min，PBS浸洗，風干，中性樹膠封片，顯微鏡下隨機選取10～20個高倍視野，計數穿膜細胞數量。

1.5移植瘤模型BALB/c裸鼠共16只，雄性，4～6周，16～18 g，飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心SPF層流房內。該中心具備動物飼養(yǎng)資質，有關操作符合動物實驗管理條例，遵循實驗動物保護福利。遵循隨機配對原則將動物分組：miR-antagomir組和miR-NC組。BGC-823細胞密度達80%～90%，按以上濃度轉染，轉染后24 h在antagomir處于最佳作用時間時收集細胞。100 mL/L水合氯醛麻醉后，于劍突下剪開0.1 cm長切口，直接注入細胞懸液(0.2 mL含1×107個/細胞)，關腹。2周后脫頸處死裸鼠，暴露腹腔，直視觀察癌細胞的播散和種植，主要剝離切口處、大網膜、腸系膜種植瘤結節(jié)。標本一部分制成石蠟切片，一部分置于液氮凍存。

1.6免疫組織化學法檢測TIMP2表達石蠟切片行免疫組織化學Elivision法檢測。切片脫蠟水化，檸檬酸高壓抗原修復，30 mL/L H2O2阻斷內源性過氧化物酶，一抗1∶200室溫孵育2 h，滴加試劑1，室溫孵育20 min，滴加試劑2，室溫孵育20 min，DAB顯色2～5 min，蘇木素淡染，封片。TIMP2表達陽性為細胞質出現棕黃色細顆粒狀物。半定量積分法判斷結果，陽性細胞百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比和染色強度乘積≥1判為陽性。

1.7Westernblot法檢測TIMP2的表達液氮凍存組織經研磨勻漿后加入RIPA裂解液裂解提取總蛋白。加入蛋白Marker，SDS-PAGE凝膠電泳分離80 V 30 min、120 V 1 h，TIMP2檢測條帶24 ku，內參β-actin條帶43 ku。在15～30 ku和35～55 ku寬度平行切膠，25 V 20 min 干轉。50 mL/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。結合一抗，TBST稀釋(1︰1 000)，4 ℃孵育過夜，次日結合二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗。ECL發(fā)光液暗室發(fā)光、顯色。

2 結 果

2.1miR-106a在胃癌細胞株中的表達差異Real-time PCR檢測在應用miR-106a antagomir后，BGC-823/anti-miR-106a組和BGC-823/negative control組miR-106a的表達差異，結果顯示miR-106a在BGC-823/anti-miR-106a組表達下調，相對表達量為2-△△Ct=0.05±0.01。Levene齊性檢驗P=0.447，兩獨立樣本t檢驗得出兩組之間miR-106a表達量有統計學差異(t=-18.001，P<0.001，圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測miR-106a表達量Fig.1 The expression of miR-106a detected by Real-time PCR method (P<0.001)

2.2miR-106a對胃癌細胞遷移和侵襲的影響Transwell遷移實驗結果表明，3組細胞BGC-823、BGC-823/anti-miR-106a，BGC-823/negative control組穿膜細胞數分別為99.00±28.11，18.80±17.01，94.23±18.15。方差齊性檢驗P=0.008，方差分析使用Welch修正值得出3組細胞穿膜數不全相等，BGC-823/anti-miR-106a組穿膜細胞數最少(P<0.001)。侵襲實驗結果表明，3組細胞的穿膜細胞數分別為74.11±49.22，16.15±8.42，83.00±42.81，方差齊性檢驗P<0.001，方差分析使用Welch修正值得出P<0.001，3組細胞穿膜數BGC-823/anti-miR-106a組最少(圖2)。

2.3miR-106a對胃癌細胞腹腔種植轉移能力的影響肉眼觀察miR-NC組胃壁癟陷，腸道粘連，內容物少，蠕動差，腹腔內癌結節(jié)滿布，大網膜可見癌結節(jié)種植，Φ平均1.3 cm；切口處癌結節(jié)凸出于皮面，Φ1.2 cm；腸系膜癌結節(jié)密布、融合，Φ 0.3～0.8 cm；個別大網膜與后腹壁粘連。miR-antagomir組腹腔癌結節(jié)明顯少，腹腔臟器之間及與腹壁之間無明顯粘連，大網膜癌結節(jié)Φ平均0.6 cm；切口處癌結節(jié)Φ 0.4 cm；腸系膜癌結節(jié)散在，Φ 0.1 cm。HE染色證實癌細胞種植，miR-antagomir組癌細胞密集成片，體積大，核質比例失調，胞質豐富，核大深染，可見多極性、頓挫性、不對稱性等病理性核分裂象，部分癌細胞中央壞死。miR-NC組癌細胞成小團巢狀分布，癌細胞周圍可見巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞等炎細胞浸潤(圖3)。

圖2 miR-106a對胃癌細胞遷移和侵襲的影響(P<0.001)Fig.2 Effect of miR-106a on migration and inva-sion of gastric cancer cells (P<0.001, ×10)

圖3 miR-106a對胃癌細胞腹腔種植轉移能力的影響Fig.3 Effect of miR-106a on peritoneal metastasis of gastric cancer cells

2.4miR-106a對目的蛋白TIMP2表達的影響免疫組織化學染色顯示，miR-antagomir組TIMP2表達呈片狀，棕褐色著色于胞質，miR-NC組TIMP2表達呈單個散在分布(圖4A)。使用等級資料的非參數檢驗得出u=49.500，P=0.039，miR-antagomir組TIMP2蛋白表達量高于miR-NC組(表1)。Western blot結果顯示，miR-antagomir組miR-106a表達缺失對應著TIMP2蛋白表達水平明顯增高(圖4B)。

表1 兩組TIMP2蛋白表達率的比較Tab.1 Comparison of TIMP2 protein level between the two groups (n=8)

圖4 miR-106a對TIMP2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of miR-106a on the expression level of TIMP2

3 討 論

關于胃癌的腹腔種植轉移，經典的研究理論認為“種子-土壤”(seed and soil)學說可解釋胃癌細胞的腹腔種植。該學說所基于的前提是認為轉移僅僅發(fā)生在適宜腫瘤生存和生長的環(huán)境中[6]。胃癌細胞侵破胃壁漿膜面從原發(fā)灶脫離后，形成游離癌細胞(free cancer cells, FCC)，FCC進入腹腔后可能會發(fā)生種植，首先是釋放一系列早期炎癥介質如TGF-β、EGF和b-FGF等導致大網膜表面間皮細胞凋亡，間皮細胞凋亡后其下血管和細胞成分裸露，細胞表面含有的配體與腫瘤細胞表面的受體結合，從而發(fā)生種植[7-8]。這一系列過程同侵襲轉移相關調控分子的功能改變是密不可分的。

本研究在體外和體內水平驗證miR-106a是否依賴于基質金屬蛋白酶家族抑制物TIMP2的作用靶點而調節(jié)生物信號通路的功能方向。通過轉染miRNA antagomir進行功能缺失性(loss-of-function)研究。體外實驗證實miR-106a功能減弱或缺失導致BGC-823細胞遷移和侵襲能力減弱，提示miR-106a在胃癌細胞的侵襲轉移過程中可能起著促癌基因樣的作用。因侵襲試驗采用基質膠，推測miR-106a可能通過溶解基底膜膠原基質促進癌細胞侵襲，為探索此機制，進一步在體內檢測侵襲轉移標記物基質金屬蛋白酶抑制物重要成員TIMP2的表達。本實驗通過HE染色證實為低分化黏液腺癌并有向印戒細胞癌轉化的傾向，此種病理類型多表現為皮革胃，容易發(fā)生腹膜播散。關于移植瘤模型有多種報道，包括胃漿膜下移植瘤和皮下多部位移植瘤等[9-10]，而我們采用的是腹部小切口注射瘤細胞的方式，該方式能夠直觀模擬游離癌細胞隨腹腔內臟器的蠕動和裸鼠的運動在腹腔內播散的情況。實驗結果表明，體內應用antagomir后，胃癌細胞的腹腔種植能力下降，表現為各臟器主要包括切口處、大網膜、腸系膜種植瘤結節(jié)數量和體積的減小，且隨著miR-106a功能減低或缺失，其對應目的蛋白TIMP2表達顯著升高。動物實驗在體內水平證實miR-106a可能通過靶向抑制TIMP2而參與胃癌的惡性進展。

現已明確miRNA的作用機制是通過識別一個或多個mRNA分子的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)，在轉錄后水平抑制mRNA翻譯或降解mRNA而調節(jié)基因的表達[11]。在miRNA家族中，已有研究報道顯示，miR-3978、miR-214等腫瘤特異性表達miRNA是能夠靶向調節(jié)胃癌轉移包括腹腔種植轉移的[12-14]。本研究鎖定miR-106a，體外和體內實驗均得出miR-106a對胃癌細胞侵襲轉移的誘導作用，且分析基質金屬蛋白酶抑制物TIMP2可能是miR-106a發(fā)揮作用的功能靶位。已知基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制物的分子平衡是維持細胞外基質(extracellular matrix, ECM)降解與完好的重要調節(jié)物質，TIMPs是MMPs的天然抑制劑。TIMP2幾乎對所有MMPs都有抑制作用，尤以TIMP2作用最強。有報道顯示，在大腸腺癌組織中，TIMP2低表達和MMP2高表達兩者之間失衡致使ECM降解是啟動腫瘤細胞黏附遷移的始動因素之一[15]。結合本實驗結果，說明當miR-106a表達受抑時，一定程度上解除了對TIMP2的表達抑制，TIMP2表達增強，TIMP2的高表達拮抗MMPs，使得MMPs表達減低，減少基底膜降解，阻抑胃癌細胞的侵襲轉移。據此，我們可以認為，miR-106a可能通過直接抑制基質金屬蛋白酶抑制物TIMP2的表達，打破TIMP-MMP之間的平衡，加速ECM降解，促進胃癌細胞的腹腔種植。

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