IL-25在支氣管哮喘中的表達(dá)變化及其機(jī)制

汪 沛，何 娟，楊麗華，盧 佩，王剛強(qiáng)，李程華，楊若凡，鄭善鑾

(西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710032)

由于近年來(lái)環(huán)境污染的持續(xù)存在，哮喘的發(fā)病率居高不下，已成為嚴(yán)重危害國(guó)民身體健康的疾病之一，也是我國(guó)兒童常見(jiàn)的呼吸道疾病。目前哮喘的發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)眾多，但氣道重塑是哮喘較為公認(rèn)的病理改變之一。白細(xì)胞介素25(interleukin-25, IL-25)又稱IL-17E，是重要的氣道上皮細(xì)胞源性細(xì)胞因子，可參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[1]。研究報(bào)道哮喘時(shí)患者血清中IL-25含量增加[2]，IL-25可促進(jìn)原代大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖活性，是導(dǎo)致氣道重塑的重要因素之一[3]。但是哮喘患者及卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)致敏的動(dòng)物模型中IL-25表達(dá)增加的分子機(jī)制尚不明確。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以O(shè)VA致敏的哮喘大鼠模型和人支氣管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討IL-25表達(dá)增加的分子機(jī)制，明確表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型20只SPF級(jí)成年雌性Sprague Dawley(SD)大鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心(西安，中國(guó))，大鼠可自由攝取食物和水。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周 后，采用隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和OVA組，OVA組大鼠皮下注射1 mL的2 g/L OVA(佐劑：100 g/L氫氧化鋁)致敏大鼠，同時(shí)肌肉注射1 mL 百日咳桿菌。第14天起每天霧化OVA激發(fā)哮喘(10 g/L的OVA，20～30 min)，連續(xù)激發(fā)7 d。對(duì)照組小鼠以生理鹽水替代處理。末次激發(fā)后處死大鼠，收集肺組織和血清，保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2人支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)及處理人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海，中國(guó))，培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清(Sigma，美國(guó))的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))。細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中(Costar，美國(guó))進(jìn)行處理。探討OVA對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞IL-25表達(dá)的影響時(shí)，采用系列質(zhì)量濃度的OVA(0、0.1、0.3、1.0、3.0和10.0 μg/mL)處理人支氣管上皮細(xì)胞，12 h后采用Trizol(Invitrogen，美國(guó))收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。探討轉(zhuǎn)錄因子AP1在OVA誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞IL-25表達(dá)中的作用時(shí)，AP1抑制劑(T-5224，10 μmol/L)預(yù)處理后再用OVA刺激人支氣管上皮細(xì)胞[4]。

1.3Real-timePCR法檢測(cè)IL-25mRNA表達(dá)取大鼠肺組織20 mg用液氮研磨成粉末后加1 mL Trizol充分裂解，細(xì)胞取Trizol保存的樣本。采用酚氯仿法提取總RNA，當(dāng)A260/A280在1.8～2.1之間可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，運(yùn)用Realtime PCR Master Mix(SYBR GREEN，Bio-Rad，美國(guó))在CFX96 Touch熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。本研究所采用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 特異性引物序列表Tab.1 Sequence of primers used in this study

1.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-25的表達(dá)采用ELISA試劑盒(R&D，美國(guó))檢測(cè)大鼠血清和人支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-25的蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

1.5Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子AP1的表達(dá)細(xì)胞處理后采用RIPA(含蛋白酶抑制劑)收集總蛋白，取50 μg總蛋白于12%的SDS-PAGE凝膠中電泳，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后，4 ℃中孵育一抗過(guò)夜(1∶1 000，武漢三鷹，中國(guó))。次日用TBST清洗未結(jié)合一抗后，室溫孵育含HRP的二抗2 h(1∶50 000，Sigma，美國(guó))。TBST清洗后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠肺內(nèi)IL-25mRNA和血清IL-25蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組相比，OVA誘導(dǎo)的哮喘大鼠肺組織IL-25 mRNA表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明哮喘大鼠血清IL-25含量亦顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 兩組大鼠肺組織IL-25 mRNA和血清IL-25蛋白表達(dá)的變化Tab.2 The expressions of IL-25 mRNA and protein in the murine lungs of both groups of rats (n=10)

2.2OVA對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞IL-25表達(dá)的影響采用系列濃度OVA處理人支氣管上皮細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-25的含量，結(jié)果顯示隨著OVA含量的增加，人支氣管上皮細(xì)胞分泌的IL-25含量逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)OVA的含量達(dá)到1 μg/mL 時(shí)IL-25的分泌達(dá)到平臺(tái)期，故而后續(xù)研究采用該水平的OVA進(jìn)行(圖1)。

圖1 OVA對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞上清液IL-25含量的影響Fig.1 The effect of OVA on the concentration of IL-25 in the supernatant of HBECs (n=4)

2.3OVA對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞AP1表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OVA處理(1 μg/mL)的人支氣管上皮細(xì)胞AP1蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 OVA對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞AP1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of OVA on the expression of AP1 protein in HBECs (n=4)

2.4AP1結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測(cè)在人類(lèi)IL-25啟動(dòng)子區(qū)域存在5個(gè)AP1結(jié)合位點(diǎn)，具體序列信息見(jiàn)表3。

2.5AP1抑制劑對(duì)OVA誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞IL-25表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，OVA(1 μg/mL)可上調(diào)人支氣管上皮細(xì)胞IL-25的分泌，而采用AP1抑制劑(T-5224，10 μmol/L)預(yù)處理30 min可部分逆轉(zhuǎn)OVA誘導(dǎo)的IL-25的分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表3 人IL-25啟動(dòng)子區(qū)域AP1結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of prediction of AP1 binding site in human IL-25 promoter

3 討 論

哮喘又稱支氣管哮喘，是我國(guó)呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前遠(yuǎn)未完全闡明，近年來(lái)國(guó)家重大研究項(xiàng)目持續(xù)資助哮喘的基礎(chǔ)與臨床研究。前期研究證實(shí)，IL-25可促進(jìn)大鼠原代氣道平滑肌增殖，可能是IL-25加重氣道重塑的分子機(jī)制之一[3]。其他研究者亦報(bào)道IL-25可通過(guò)多種機(jī)制參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[5]。但哮喘時(shí)IL-25表達(dá)增加的分子機(jī)制尚未明確。本研究首次報(bào)道人支氣管上皮細(xì)胞在遭受OVA刺激時(shí)可合成并分泌IL-25，并且其機(jī)制與OVA上調(diào)AP1的表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步闡明了IL-25參與哮喘的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)以IL-25為靶點(diǎn)的哮喘治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

支氣管上皮細(xì)胞在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。最新研究報(bào)道，氣道上皮細(xì)胞是糖皮質(zhì)激素治療小鼠哮喘的重要靶細(xì)胞[6]，而哮喘時(shí)氣道上皮細(xì)胞可分泌多種炎癥因子和趨化因子，募集嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞[7]。已知支氣管上皮細(xì)胞可分泌IL-25參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[5]，本研究以人支氣管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)OVA可呈劑量依賴性上調(diào)IL-25的合成與分泌。進(jìn)一步證實(shí)上皮細(xì)胞來(lái)源的IL-25是哮喘的重要致病機(jī)制之一。OVA是外源性抗原物質(zhì)，一般用于哮喘整體動(dòng)物的構(gòu)建[3,8-9]，本研究發(fā)現(xiàn)，OVA在體外研究亦可刺激支氣管上皮細(xì)胞分泌IL-25，具有生物活性。國(guó)內(nèi)亦有研究表明OVA在體外可刺激T淋巴細(xì)胞分泌IL-5[10]，表明OVA的體外研究是行之有效的方法。

AP1是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控上皮的基因表達(dá)，AP1功能異?？筛淖兘琴|(zhì)細(xì)胞的增殖和分化[11]，同時(shí)AP1也參與上皮細(xì)胞的多種生理病理過(guò)程，例如TGF上調(diào)MMP9的表達(dá)是AP1依賴性的[12]。本研究通過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在人支氣管上皮細(xì)胞的啟動(dòng)子區(qū)域存在5個(gè)AP1的結(jié)合位點(diǎn)，強(qiáng)烈提示AP1是調(diào)控人支氣管上皮細(xì)胞IL-25表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。而抑制AP1的轉(zhuǎn)錄活性可部分逆轉(zhuǎn)OVA誘導(dǎo)的IL-25分泌，提示AP1參與了哮喘時(shí)氣道上皮細(xì)胞IL-25的合成與分泌。

綜上所述，本研究首次報(bào)道OVA可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞合成與分泌IL-25，后者可能通過(guò)旁分泌方式促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，參與氣道重塑。同時(shí)發(fā)現(xiàn)AP1是OVA誘導(dǎo)IL-25表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究為開(kāi)發(fā)以IL-25為靶點(diǎn)的哮喘治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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