桔梗皂苷D對(duì)阿霉素體外抗肝癌活性的干預(yù)作用及其機(jī)制研究

鄭璟瑤 徐廣濤

由于肝癌的惡性程度高，肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)，因此肝癌的致死率很高，患者預(yù)后差[1]。阿霉素（多柔比星）是一種抗腫瘤抗生素，具有廣譜的抗腫瘤活性，在肝癌的化療中具有重要的作用，能明顯抑制肝癌細(xì)胞中DNA的復(fù)制和修復(fù)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[2-3]。然而大劑量使用阿霉素的毒副反應(yīng)，特別是對(duì)心臟的毒性也很大[4-5]。因此，采取輔助治療方法提高肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，降低其使用劑量具有十分重要的意義。本研究觀察桔梗皂苷D對(duì)阿霉素體外抗肝癌活性的干預(yù)作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco。Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：APOAF）、噻唑藍(lán)（MTT）、二氫乙啶（DHE）、桔梗皂苷D、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和阿霉素購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。ASK1抗體、磷酸化ASK1抗體和ASK1小干擾RNA購(gòu)于美國(guó)Santa Cruze?；罨虲aspase-3抗體、磷酸化JNK抗體和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（批號(hào)：32106）購(gòu)于美國(guó)Pierce。脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購(gòu)于美國(guó) Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系PLC購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 將PLC細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組、桔梗皂苷D組、阿霉素組、阿霉素+桔梗皂苷D組、阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組和阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組。對(duì)照組為PLC細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，阿霉素組為在PLC細(xì)胞中加入0.5μmol/L的阿霉素培養(yǎng)48h，桔梗皂苷D組為在PLC細(xì)胞中加入1μmol/L的桔梗皂苷D培養(yǎng)48h，阿霉素+桔梗皂苷D組為在PLC細(xì)胞中加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D培養(yǎng)48h，阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組為在PLC細(xì)胞中加入0.5μmol/L的阿霉素、1μmol/L的桔梗皂苷D和2mmol/L NAC培養(yǎng)48h，阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組為先將50ρmol/mL的ASK1小干擾RNA轉(zhuǎn)染入PLC細(xì)胞中培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在PLC培養(yǎng)孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養(yǎng)4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，PLC細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡 將PLC細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書用Annexin-V對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20min。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PLC細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.5 ROS測(cè)定 將細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后在PLC細(xì)胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PLC細(xì)胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生。由于DHE在ROS的氧化作用下能發(fā)出紅色熒光，因此PLC細(xì)胞發(fā)出的紅色熒光越強(qiáng)則ROS水平越高[6]。

1.6 Western blot 將細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上，用ASK1抗體、磷酸化ASK1抗體、活化型Caspase-3抗體、磷酸化JNK抗體或GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示并用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PLC細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率比較 MTT和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素+桔梗皂苷D組PLC細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率均顯著高于阿霉素組和桔梗皂苷D組（P均＜0.05），見表 1。

表1 各組PLC細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率比較（%±s）

表1 各組PLC細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率比較（%±s）

注：與阿霉素組比較，▲P＜0.05；與桔梗皂苷 D 組比較，△P＜0.05；與阿霉素+桔梗皂苷D組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組阿霉素組桔梗皂苷D組阿霉素+桔梗皂苷D組阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組孔數(shù)333333細(xì)胞活力抑制率0 15.2±1.4 7.2±0.5 61.5±5.1▲△25.8±2.0*19.7±1.6*凋亡誘導(dǎo)率1.7±0.2 7.6±0.6 2.9±0.3 36.8±2.9▲△12.4±1.1*10.8±0.9*

2.2 各組PLC細(xì)胞ASK1表達(dá)水平比較 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桔梗皂苷D處理能明顯增加PLC細(xì)胞ASK1的表達(dá)水平，而阿霉素處理對(duì)ASK1的表達(dá)水平無(wú)影響。阿霉素能誘導(dǎo)ASK1發(fā)生磷酸化，而桔梗皂苷D雖不能直接誘導(dǎo)ASK1的磷酸化，但能促進(jìn)阿霉素依賴的ASK1磷酸化水平（見封四圖1）。為了判斷桔梗皂苷D發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制是否與ASK1上調(diào)有關(guān)，本研究在PLC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASK1小干擾RNA以沉默ASK1基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ASK1小干擾RNA能顯著減弱桔梗皂苷D聯(lián)合阿霉素對(duì)PLC細(xì)胞活力的抑制和凋亡的誘導(dǎo)（P＜0.05）（見表1），表明桔梗皂苷D可能通過上調(diào)ASK1表達(dá)水平從而增強(qiáng)阿霉素依賴的ASK1的磷酸化，促進(jìn)阿霉素對(duì)PLC細(xì)胞的殺傷活性。

2.3 阿霉素聯(lián)合桔梗皂苷D對(duì)ROS/ASK1/JNK信號(hào)途徑的影響 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素處理能誘導(dǎo)PLC細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，然而桔梗皂苷D對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平無(wú)影響（見封四圖2）。將PLC細(xì)胞用ROS清除劑NAC[6]處理后，阿霉素聯(lián)合桔梗皂苷D對(duì)ASK1磷酸化的誘導(dǎo)受到明顯抑制（見封四圖1），結(jié)果表明桔梗皂苷D聯(lián)合阿霉素對(duì)PLC的殺傷活性依賴于ROS的產(chǎn)生，而ROS是ASK1的上游信號(hào)分子，桔梗皂苷D雖不能直接誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，但能通過上調(diào)ASK1的表達(dá)增強(qiáng)阿霉素依賴的ROS/ASK1信號(hào)通路。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桔梗皂苷D聯(lián)合阿霉素顯著誘導(dǎo)PLC細(xì)胞JNK蛋白的磷酸化，但轉(zhuǎn)染ASK1小干擾RNA后，桔梗皂苷D不能增強(qiáng)阿霉素依賴的PLC細(xì)胞中JNK蛋白的磷酸化（見封四圖3），桔梗皂苷D聯(lián)合阿霉素能顯著誘導(dǎo)PLC細(xì)胞中凋亡執(zhí)行分子Caspase-3活化，而轉(zhuǎn)染ASK1小干擾RNA或采用NAC處理均能抑制Caspase-3活化（見封四圖3），表明桔梗皂苷D聯(lián)合阿霉素可能通過ROS/ASK1/JNK途徑增強(qiáng)阿霉素對(duì)PLC細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。

3 討論

桔梗皂苷D是桔梗總皂苷的主要活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，桔梗皂苷D還具有一定的抗腫瘤活性，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和周期阻滯[7-9]，然而其對(duì)化療藥物的協(xié)同抗肝癌活性至今仍很少報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，桔梗皂苷D聯(lián)合處理能顯著提高肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，表明桔梗皂苷D能作為一種輔助治療藥物增強(qiáng)阿霉素對(duì)肝癌的治療效果，降低阿霉素的使用劑量。

ROS是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要信號(hào)分子，阿霉素等化療藥物在很大程度上通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)其發(fā)生凋亡性死亡而發(fā)揮抗腫瘤活性[10-11]。在ROS誘導(dǎo)的信號(hào)通路中，JNK是激活細(xì)胞凋亡的重要下游分子，ROS通過激活A(yù)SK1蛋白的磷酸化誘導(dǎo)JNK的活化，而活化的JNK能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中促凋亡蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素聯(lián)合桔梗皂苷D對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性依賴于細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。桔梗皂苷D發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制可能是其能上調(diào)肝癌細(xì)胞ASK1蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS對(duì)ASK1蛋白的磷酸化，ASK1蛋白磷酸化又激活JNK的活化，從而使肝癌細(xì)胞發(fā)生了JNK依賴的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，桔梗皂苷D對(duì)阿霉素有協(xié)同抗肝癌效應(yīng)。桔梗皂苷D可能通過上調(diào)ASK1表達(dá)促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。

［1］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［2］ Fang S，Qiu J，Guo W，et al.Down-regulation of UBC9 increases the sensitivity of hepatocellular carcinoma to doxorubicin［J］.Oncotarget，2017，8（30）：49783-49795.

［3］ Pan C，Wang X，Pan Z，et al.MiR-122 Reverses the Doxorubicin-Resistance in Hepatocellular Carcinoma Cells through Regulating the Tumor Metabolism［J］.PLoS One，2016，11（5）：e0152090.

［4］Koleini N，Kardami E.Autophagy and mitophagy in the context of doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］.Oncotarget，2017，8（28）：46663-46680.

［5］ Zhao L，Zhang B.Doxorubicin induces cardiotoxicity through upregulation of death receptors mediated apoptosis in car－diomyocytes［J］.Sci Rep，2017，16（7）：44735.

［6］ Jiang K，Wang W，Meng G，et al.Silibinin，a natural flavonoid，induces autophagy via ROS-dependent mitochondrial dysfunction and loss of ATP involving BNIP3 in human MCF7 hepatocellular carcinoma cells［J］.Oncol Rep，2015，33（6）：2711-2718.

［7］ Li T，Xu WS，Lu JJ，et al.Platycodin D induces apoptosis，and inhibits adhesion，migration and invasion in HepG2 hepatocellular carcinoma cells［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（4）：1745-1749.

［8］ Qin H，Du X，Wang R，et al.Platycodin D，a triterpenoid saponin from Platycodon grandiflorum，induces G2/M arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells by modulating the PI3K/Akt pathway［J］.Tumour Biol，2014，35（2）：1267-1274.

［9］ Dai Q，Chen Z，Wu BH，et al.Mechanism of platycodin D-induced apoptosis in A549 human lung cancer cells［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2012，37（17）：2626-2629.

［10］Wu H，Liu S，Li Y，et al.VCPA，a novel synthetic derivative of α-tocopheryl succinate，sensitizes human gastric cancer to doxorubicin-induced apoptosis via ROS-dependent mitochondrialdysfunction［J］.CancerLett，2017，1（393）：22-32.

［11］ Kim J，Shim M.COX-2 inhibitor NS-398 suppresses doxorubicin-induced p53 accumulation through inhibition of ROS-mediated Jnk activation［J］.Mol Carcinog，2016，55（12）：2156-2167.

［12］ Liang T，Zhang X，Pei J，et al.Curcumin induced human gastric cancer BGC-823 cells apoptosis by ROS-mediated ASK1-MKK4-JNK stress signaling pathway［J］.Int J Mol Sci，2014，15（9）：15754-15765.

［13］ Li HY，Zhang J，Ye ZM，et al.Celastrol induces apoptosis and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells：an in vitro and in vivo study［J］.Cell Death Dis，2015，6（1）：e1604.

［14］Zhang L，Zhou M，Tang Y，et al.miR-92a inhibits vascular smooth muscle cell apoptosis：role of the MKK4-JNK pathway［J］.Apoptosis，2014，19（6）：975-983.