大黃魚微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的開發(fā)及其研究進(jìn)展

李宇生

摘 要：本文通過概述了大黃魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)現(xiàn)狀的研究成果和應(yīng)用進(jìn)展，以期為微衛(wèi)星標(biāo)記方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖遺傳學(xué)研究方向的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：大黃魚 ； 微衛(wèi)星標(biāo)記 ； 研究

大黃魚，硬骨魚綱，鱸形目，石首魚科，黃魚屬。又名黃魚是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，曾有中國“海洋四大經(jīng)濟(jì)魚類”之稱。大黃魚肉質(zhì)較好且味美，魚鰾可干制成名貴食品“魚肚”，又可制“黃魚膠”。大黃魚肝臟含維生素A，為制魚肝油的好原料。耳石可作藥用。自1987年突破人工繁殖以來，大黃魚養(yǎng)殖規(guī)模和范圍不斷擴(kuò)大，至2010年，已形成年產(chǎn)8.6 萬噸，產(chǎn)值約65 億元的產(chǎn)業(yè)。但是，在大黃魚人工養(yǎng)殖與繁育中發(fā)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)性狀，尤其是魚肉品質(zhì)及抗病力等方面出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的衰退。分析大黃魚的遺傳多樣性，對保護(hù)和利用資源，建立良種培育體系有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開發(fā)了RAPD、RFLP、AFLP等標(biāo)記，由于微衛(wèi)星標(biāo)記有優(yōu)于其它標(biāo)記的諸多特點(diǎn)，在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單序列重復(fù)，是以1-6個(gè)核苷酸為基本單位（核心序列），首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列。根據(jù)核心序列排列方式的不同，Weber等將微衛(wèi)星分為完全、不完全和復(fù)合型三類。（1）完全型微衛(wèi)星是指核心序列以不間斷的重復(fù)方式首尾相連構(gòu)成；（2）不完全型微衛(wèi)星是指在微衛(wèi)星的核心序列之間有3個(gè)以下的非重復(fù)堿基，但其兩端的連續(xù)的核心序列重復(fù)數(shù)大于3；（3）復(fù)合型微衛(wèi)星是指兩種或兩種以上的串聯(lián)核心序列由3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，連續(xù)的核心序列重復(fù)數(shù)不少于5。由于核心序列的重復(fù)數(shù)不同，引起了物種間，甚至種內(nèi)不同個(gè)體間微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性。研究表明， 不同的物種微衛(wèi)星的含量和分布各不相同，并且微衛(wèi)星的重復(fù)類型在不同的生物中也差異很大。

微衛(wèi)星標(biāo)記屬于特異性標(biāo)記，其引物開發(fā)要在明確物種DNA序列的前提下進(jìn)行，所以開發(fā)成本較大。目前從動(dòng)物基因組中獲得微衛(wèi)星標(biāo)記的途徑有多種，以下方法被用于大黃魚微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的開發(fā)中。

一、從DNA文庫中開發(fā)

生物信息學(xué)技術(shù)是微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記開發(fā)的有力工具之一。目前，東方紅鰭豚、文昌魚和海膽等海產(chǎn)動(dòng)物的全基因組測序已完成，積累了大量的基因組序列和表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）數(shù)據(jù)，NCBI，EMBL，DDBJ和GDB等數(shù)據(jù)庫為微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的資源。大黃魚EST序列有4200個(gè)在GenBank上注冊。基于生物信息學(xué)技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記的基本流程包括，從公共基因數(shù)據(jù)庫（如EMBL、GenBank和DDBJ等）下載DNA序列（多為EST數(shù)據(jù)），然后利用相應(yīng)軟件尋找含有SSR的序列，最后根據(jù)其兩端的保守性序列設(shè)計(jì)SSR引物并進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。

謝芳靖等通過構(gòu)建大黃魚性腺線性化cDNA 文庫，并經(jīng)測序后獲得3535條EST，對其二堿基至六堿基重復(fù)序列進(jìn)行篩選，共發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)150個(gè)，占EST序列的4.24%；其中包括二堿基重復(fù)序列64條，三堿基重復(fù)序列80條，四堿基重復(fù)序列5條，五堿基重復(fù)序列1條；三堿基重復(fù)序列是最豐富的重復(fù)單元，占53.3%。在這些微衛(wèi)星序列中，（TG/GT/AC/CA）n形式在二堿基重復(fù)中最為常見，（GAG/AGG/GGA/CCT）n形式在三堿基重復(fù)序列中最為常見，分別占微衛(wèi)星序列總數(shù)的26%和14%。選取其中的62條微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、合成與多態(tài)性檢測，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，2.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得呈多態(tài)性微衛(wèi)星引物8對，多態(tài)率為12.9%。李紅梅等通過對大黃魚全基因組中的微衛(wèi)星重復(fù)序列進(jìn)行搜索，在長度為619Mbd的大黃魚基因組中，共發(fā)現(xiàn)68008個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)序列，其序列總長度約占全基因組序列的0.47%。共發(fā)現(xiàn)單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸等6種微衛(wèi)星類型，在微衛(wèi)星序列中，二核苷酸重復(fù)序列最多，約占微衛(wèi)星序列總數(shù)的71.03%，四核苷酸重復(fù)類型排在第二位，占11.88%。而在二核苷酸重復(fù)類型中，以AC基序列含量最多，占到二堿基重復(fù)類型的90.18%。

二、基因組文庫富集法

為提高開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的效率，降低成本，許多科研人員研發(fā)了不同的技術(shù)，構(gòu)建SSR富集文庫。將基因組DNA經(jīng)酶切后與微衛(wèi)星探針雜交，使標(biāo)記在探針上的生物素與磁珠表面的鏈親和素之間結(jié)合，或固定在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，就可將微衛(wèi)星富集，通過克隆和測序得到微衛(wèi)星DNA，此種方法提高了獲得陽性克隆的效率，富集效率可達(dá)到50%-90%。

郭葳等采用生物素——磁珠富集微衛(wèi)星，構(gòu)建篩選了部分的大黃魚的微衛(wèi)星文庫，分離得到36個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記；郝君等同樣采用磁珠富集微衛(wèi)星，與傳統(tǒng)放射性同位素雜交法相結(jié)合，篩選出22對可用引物。

三、其他方法

以RAPD為基礎(chǔ)的PCR法，將RAPD擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)移至膜上，與微衛(wèi)星探針雜交，獲得陽性RAPD片段后進(jìn)行克隆。林能鋒等以M13通用引物和根據(jù)微衛(wèi)星核心序列所設(shè)計(jì)的引物，用PCR 法直接對文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得15個(gè)PCR陽性克隆，對陽性克隆測序。寧岳等以擬側(cè)交法構(gòu)建了大黃魚第一代遺傳連鎖圖譜，其中就包含有15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。李紅梅等通過在完整的微衛(wèi)星序列側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，共成功篩選出73對微衛(wèi)星引物。

四、結(jié)語

研究表明，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記較其他標(biāo)記有眾多優(yōu)勢：微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目多，多態(tài)性信息量大；目前，大黃魚有較多的可利用的微衛(wèi)星引物，而且在遺傳多樣性方面研究較多，因此對開展大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種方面的研究是很有必要的。