5-氨基酮戊酸光動力學(xué)診斷腹膜轉(zhuǎn)移癌的研究進(jìn)展

姬忠賀 劉 洋 Yutaka Yonemura,3 李 雁*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腹膜腫瘤外科, 北京 100038; 2.Peritoneal Surface Malignancy Center, Kishiwada Tokushukai Hospital, 4-27-1 Kamori-Cho, Kishiwada City, Osaka 596-8522, Japan; 3.NPO Organization to Support Peritoneal Surface Malignancy Treatment, 510 Fukushima-Cho, Shimogyou-Ku, Kyoto 600-8189, Japan)

腹膜轉(zhuǎn)移癌(peritoneal metastasis, PM)一直被視作癌癥的終末階段，其主要治療手段包括姑息手術(shù)或化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)，預(yù)后極差。近30年來，腫瘤學(xué)界建立了一套以細(xì)胞減滅術(shù)(cytoreductive surgery, CRS)加術(shù)中腹腔熱灌注化療(hyperthermic intraperitoneal chemotherapy, HIPEC)為主，聯(lián)合術(shù)后腹腔化療和系統(tǒng)化療的綜合治療策略，可有效延長部分經(jīng)謹(jǐn)慎選擇的PM患者生存期[1]。腹膜癌指數(shù)(peritoneal cancer index, PCI)和細(xì)胞減滅程度(completeness of cytoreduction, CCR)是該綜合治療后最重要的獨立生存預(yù)測因子[2]。然而，現(xiàn)行手術(shù)技術(shù)容易遺漏肉眼難以發(fā)現(xiàn)的隱匿部位PM或微小癌灶，即便經(jīng)過徹底的CRS，術(shù)后腹膜復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%[3]。亟需發(fā)展新方法檢測PM微小癌灶。近年來，氨基酮戊酸(aminolevulinic acid, ALA)光動力學(xué)診斷(photodynamic diagnosis, PDD)方法逐漸發(fā)展，并用于檢測胃腸道惡性腫瘤、卵巢癌和惡性間皮瘤來源PM[4]。本綜述旨在總結(jié)ALA-PDD的基本原理、基礎(chǔ)和臨床研究現(xiàn)狀。

1 ALA-PDD的基本原理

1.1 原卟啉IX(protoporphyrin IX, PpIX)的生物合成與代謝

ALA是PpIX和亞鐵血紅素的天然前體。人體內(nèi)，琥珀酰輔酶A和甘氨酸在ALA合成酶的催化下，于細(xì)胞線粒體合成ALA，被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，在限速酶ALA脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)化為膽色素原，再經(jīng)系列酶促反應(yīng)后生成PpIX。PpIX可在限速酶亞鐵螯合酶的催化下轉(zhuǎn)化為亞鐵血紅素，亦可由線粒體轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，并經(jīng)細(xì)胞膜上的ABCG2外流轉(zhuǎn)運(yùn)子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外(圖1)。

圖1 原卟啉IX和亞鐵血紅素的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of protoporphyrin IX and hemeALA：aminolevulinic acid；PpIX：protoporphyrin IX.

大量外源性ALA進(jìn)入人體后，可經(jīng)癌細(xì)胞膜表面的PEPT1內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入癌細(xì)胞，導(dǎo)致PpIX合成增加并在癌細(xì)胞內(nèi)蓄積，在405 nm紫光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光[5]。

1.2 PpIX的選擇性蓄積

PpIX在癌細(xì)胞和癌組織內(nèi)的選擇性蓄積是實現(xiàn)ALA-PDD的理論基礎(chǔ)。PpIX在癌細(xì)胞中選擇性蓄積的機(jī)制主要是酶學(xué)機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)子機(jī)制。

1.2.1 酶學(xué)機(jī)制

如圖1所示，PpIX的合成受亞鐵血紅素含量反饋調(diào)控。而亞鐵血紅素合成途徑中任何一種酶(尤其是限速酶)表達(dá)量的變化都有可能影響PpIX的含量，從而影響熒光信號。

亞鐵螯合酶在PpIX選擇性蓄積中的作用目前仍有爭議。Kaneko等[6]的研究顯示，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，亞鐵螯合酶的活性較正常腦組織低。給予外源性ALA后，正常腦細(xì)胞線粒體中大量合成PpIX，并通過亞鐵螯合酶代謝為亞鐵血紅素，從而使PpIX含量下降；而惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞鐵螯合酶含量低，導(dǎo)致PpIX在胞內(nèi)蓄積。Hagiya等[7]研究顯示，膀胱癌中亞鐵螯合酶表達(dá)下調(diào)，給予外源性ALA后，膀胱癌細(xì)胞中PpIX含量升高。然而，Yonemura等[8]報道，PM中PpIX含量不依賴于亞鐵螯合酶活性，該研究顯示PM組織中亞鐵螯合酶和ALA-PDD熒光狀態(tài)無相關(guān)性，PM組織中亞鐵螯合酶的表達(dá)量與PpIX含量無關(guān)。Hagiya等[9]報道，在5種胃癌細(xì)胞系中，亞鐵血紅素合成途徑中涉及的八種酶的表達(dá)水平相同，且與ALA熒光無相關(guān)性。

1.2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)子機(jī)制

ALA轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)與代謝可促進(jìn)PpIX選擇性蓄積[10]。ALA內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)子PEPT1和卟啉外流轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCG2在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PpIX水平上發(fā)揮重要作用[7, 9, 11]。

PEPT1表達(dá)于癌細(xì)胞膜，通過與協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白H+/H3O+結(jié)合，攝取ALA[9]。在胃癌細(xì)胞系中上調(diào)PEPT1基因和下調(diào)ABCG2基因，可促進(jìn)ALA誘導(dǎo)的PpIX特異性腫瘤蓄積[9]。Yonemura等[8]報道，PEPT1高表達(dá)的PM中，PpIX含量顯著上升，PEPT1 mRNA的表達(dá)量與ALA-PDD熒光狀態(tài)顯著相關(guān)。

ABCG2是PpIX外流轉(zhuǎn)運(yùn)子，表達(dá)于癌細(xì)胞膜上，其表達(dá)量與ALA-PDD熒光狀態(tài)顯著相關(guān)。Yonemura等[8]報道，同時表達(dá)PEPT1 mRNA和ABCG2 mRNA的PM組織中，88.2%(15/17)ALA-PDD熒光陽性；ABCG2基因上調(diào)或PEPT1基因下調(diào)的PM組織中，75%(6/8)ALA-PDD熒光陰性。

臨床標(biāo)本中，PEPT1、ABCG2的免疫反應(yīng)性與ALA-PDD熒光狀態(tài)顯著相關(guān)，提示臨床上可通過免疫組織化學(xué)法檢測組織中PEPT1和ABCG2的表達(dá)情況，篩選適用ALA-PDD的患者[8]。

ABCB6介導(dǎo)亞鐵血紅素合成中間產(chǎn)物糞卟啉原Ⅲ由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體。研究[7]顯示ALA-PDD熒光陽性的膀胱癌標(biāo)本中，ABCG6表達(dá)下調(diào)；胃癌細(xì)胞系中，ABCG6的表達(dá)量與ALA-PDD熒光無關(guān)[9]。

然而，部分ALA-PDD陽性PM，既不表達(dá)PEPT1也不表達(dá)ABCG2，而ALA-PDD陰性PM同時表達(dá)兩者。目前，對PpIX如何跨線粒體膜返回細(xì)胞質(zhì)知之甚少。其他未知的ALA內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)子和卟啉外流轉(zhuǎn)運(yùn)子可能與PpIX蓄積相關(guān)。此外，亞鐵離子的性質(zhì)變化及環(huán)境因素如pH值、血供、淋巴回流等，可能與PM組織中PpIX選擇性蓄積相關(guān)。

1.3 ALA-PDD檢測PM的基本原理

大部分PM伴PEPT1過表達(dá)，大量外源性ALA處理后，ALA通過PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，在ALA脫氫酶催化下激活亞鐵血紅素合成途徑，癌細(xì)胞內(nèi)PpIX含量增加，從而上調(diào)亞鐵螯合酶和ABCG2的表達(dá)[8, 12]。部分PpIX在亞鐵螯合酶作用下迅速代謝為亞鐵血紅素，與此同時，PpIX通過ABCG2從癌細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致PpIX在腫瘤局部基質(zhì)內(nèi)過量蓄積。闌尾黏液性腫瘤來源的PM中，腫瘤細(xì)胞成分相對較少，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的黏液成分廣泛分布于基質(zhì)組織，PpIX在黏液中蓄積，PDD下發(fā)出強(qiáng)紅色熒光。在膀胱癌[7]和胃癌細(xì)胞系[9]中，PEPT1基因上調(diào)和ABCG2基因下調(diào)，ALA-PDD狀態(tài)取決于亞鐵血紅素的表達(dá)量。而PM中，PEPT1和ABCG2基因同時上調(diào)，PM組織中PpIX含量提高，呈ALA-PDD熒光陽性。

Yonemura等[12]報道，正常腹膜組織中，PEPT1 mRNA表達(dá)率為25%(10/40)，ABCG2 mRNA表達(dá)率為48.4%(18/40)，亞鐵螯合酶mRNA表達(dá)率70.0%(28/40)。正常腹膜組織中PpIX含量顯著低于PM組織[(0.007 3 ± 0.004 1)nm/mgvs(0.010 9 ± 0.003 1) nm/mg]。正常間皮細(xì)胞內(nèi)，PpIX可通過ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)子分泌至腹腔，或通過亞鐵螯合酶代謝為亞鐵血紅素，保持PpIX低含量。因此，正常腹膜組織中的PpIX含量不足以在紫光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光[8]。

2 ALA-PDD診斷PM的實驗研究

多項動物實驗研究[13-21]已驗證了ALA-PDD診斷PM的安全性和可行性(表1)。這些研究涉及臨床常見的PM類型，包括上皮性卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌等，ALA給藥方式為靜脈給藥、腹腔給藥和口服給藥。

表1 ALA-PDD診斷PM的動物實驗研究Tab.1 ALA-PDD for detecting PM in animal models

ALA: aminolevulinic acid;PDD:photodynamic diagnosis;PM: peritoneal metastasis;EOC: epithelial ovarian carcinoma;CC: colon cancer;GC: gastric cancer;HAL: hexaminolaevulinate;IV: intravenous;IP: intraperitoneal;PO: per os;NR: not reported.

Hornung等[13]報道，24只Fischer 344小鼠經(jīng)腹腔注射卵巢癌細(xì)胞制作PM模型，接種4周后，靜脈給予ALA 100 mg/kg，之后1、3、6、9 h時診斷性開腹，結(jié)果顯示靜脈給藥1～3 h最適合PDD。

Canis等[14]將100 mg/kg ALA注射于上述PM大鼠模型腹腔內(nèi)，3 h后在內(nèi)鏡下行PDD。對于腫瘤直徑小于2 mm PM，白光下中位PM檢出量為3(范圍0～7)，ALA-PDD下中位PM檢出量是5(范圍1～11)(P<0.000 8)，ALA-PDD技術(shù)可以顯著提高微小轉(zhuǎn)移灶的檢出率。

Lüdicke等[16]報道，在卵巢癌動物模型中，腹腔應(yīng)用ALA衍生物——hexaminolaevulinate(HAL)檢測微轉(zhuǎn)移有可行性。無癌細(xì)胞的腹膜未顯示熒光，與腫瘤結(jié)節(jié)明顯區(qū)分開；PDD藍(lán)光下檢測到PM病灶數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)明場下檢出量的2倍，尤其是可檢測到直徑0.1～0.4 mm的PM微小病灶；通過后續(xù)嚴(yán)格的組織學(xué)驗證，HAL熒光陽性PM無假陽性；該研究提示使用ALA的活性代謝物可進(jìn)一步提高檢出率。

Gahlen等[19]將ALA注射于結(jié)腸癌PM大鼠模型內(nèi)，動物分為ALA腹腔給藥(約440～550 mg/kg)和ALA靜脈給藥(100 mg/kg)兩組，4 h后行PDD腹腔鏡診斷。ALA腹腔給藥組白光下發(fā)現(xiàn)142處腫瘤結(jié)節(jié)，而PDD能發(fā)現(xiàn)172處腫瘤結(jié)節(jié)；ALA靜脈給藥組白光下發(fā)現(xiàn)116處腫瘤結(jié)節(jié)，PDD能發(fā)現(xiàn)124處腫瘤結(jié)節(jié)；所有結(jié)節(jié)均經(jīng)病理確診為轉(zhuǎn)移灶。該研究說明腹腔內(nèi)給藥的檢出率更高。

3 ALA-PDD在PM中的臨床研究

3.1 ALA PDD方法及細(xì)胞減滅術(shù)ALA導(dǎo)航

給予ALA前，應(yīng)通過抗體篩查和Hoesch檢測，排除卟啉癥患者[22]。ALA-PDD臨床研究有3種給藥形式：腹腔、靜脈和口服給藥。

腹腔給藥后，ALA既可以直接滲透至深部種植的癌細(xì)胞，也可被腹膜淋巴管和血管吸收經(jīng)循環(huán)到達(dá)PM組織，醫(yī)生需要等幾個小時后才能開始ALA-PDD，一般建議在腹腔給予ALA 3～5 h后進(jìn)行ALA-PDD[23]。腹腔應(yīng)用ALA后腹腔鏡熒光檢測比靜脈應(yīng)用能獲得更高的腹腔內(nèi)劑量，能更高效的檢測到微小或隱匿PM病灶[18]。

靜脈給藥的通常劑量為10～30 mg/kg，行ALA-PDD診斷時PM最大熒光出現(xiàn)在靜脈給藥后1～3 h之間。

口服給藥的優(yōu)點是無創(chuàng)應(yīng)用、便捷安全，通常將20 mg/kg 5-ALA溶解于50～100 mL橙汁中，術(shù)前2 h服用。開腹后，首先明場下評估PM大小和分布，然后關(guān)閉手術(shù)室燈光，用氙燈照射375～445 nm的紫光作為激發(fā)光行PDD，觀察腹腔所有區(qū)域。接著行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和腹腔熱灌注化療。徹底清除肉眼可見腫瘤后，再次使用ALA-PDD尋找殘余瘤。

不同給藥方式的顯像時間不同，主要是由顯像原理決定的?？诜?-ALA后，迅速被上消化道吸收入血，血漿5-ALA濃度1 h內(nèi)達(dá)峰值，2～4 h后，PpIX在正常組織，尤其是胃腸黏膜中蓄積；接著正常組織中的PpIX逐步代謝，而腫瘤細(xì)胞中會維持一段時間；6 h后，正常組織和腫瘤組織中PpIX濃度差異達(dá)峰值[24]。由此可見，顯像時間與患者胃腸功能、代謝狀態(tài)相關(guān)。一般術(shù)前2～3 h口服給藥，術(shù)中可獲得較好的檢測效果。靜脈給藥省略了藥物吸收入血的過程，給藥約2 h后，PpIX濃度即達(dá)峰值。一般行ALA-PDD前1～3 h內(nèi)給藥，可獲得最大熒光。系統(tǒng)給藥(口服、靜脈)占用手術(shù)室時間短、操作便捷、監(jiān)護(hù)簡單，尤其是口服給藥被廣泛采用，其不足之處在于，皮膚及其他臟器藥物濃度高，檢測假陰性率高、診斷靈敏度一般，易發(fā)生不良反應(yīng)。

腹腔給藥與系統(tǒng)給藥方式不同，系通過腹膜表面直接滲透進(jìn)入腹膜及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，藥物入血少，可獲得較高的腹腔藥物劑量，不良反應(yīng)少，但是直接滲透耗時較長，一般在腹腔給予ALA后3～5 h行PDD檢測。腹腔給藥大部分直接滲透，少量進(jìn)入血液循環(huán)，因此對腹膜深層的腫瘤細(xì)胞檢測效果一般。

3.2 ALA PDD診斷不同來源PM試驗結(jié)果

已經(jīng)有多項ALA-PDD檢測PM的臨床試驗[4，8，13，25-26](表2)。其中4項研究中ALA采用口服給藥，1項研究為ALA腹腔給藥。ALA劑量范圍為10～30 mg/kg。腹腔給藥孵育時間為5 h，而口服給藥僅需2～3 h。靈敏度范圍為46%～100%，特異度為100%。

ALA-PDD檢測PM的總檢出率為56.6%(81/143)，PDD能夠提高大部分卵巢癌(84.6%)、間皮瘤(62.5%)、胰腺癌(75.0%)標(biāo)本的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)檢出率。此外，在60%的結(jié)腸癌PM中，可檢測到轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。在胃癌PM和闌尾黏液腫瘤中，PDD檢測率較低，分別為25.7%和16.4%，詳見表3[8]。

表2 ALA-PDD檢測腹膜轉(zhuǎn)移臨床試驗結(jié)果Tab.2 ALA-PDD for detecting PM in clinical trials

ALA: aminolevulinic acid;PDD:photodynamic diagnosis;EOC: epithelial ovarian carcinoma;PM: peritoneal metastasis;GC: gastric cancer;IP: intraperitoneal;PO: per os;NR: not reported.

表3 不同原發(fā)部位PM行ALA-PDD的陽性率[8]Tab.3 Positive rate of ALA-PDD for detecting PM ofdifferent origins

PM: peritoneal metastasis；ALA: aminolevulinic acid;PDD:photodynamic diagnosis.

ALA熒光取決于PM組織中光敏化PpIX的含量(表4)[8]、腫瘤細(xì)胞在腹膜上的定位和術(shù)前化療。位于深部腹膜下層組織的癌細(xì)胞無法被PDD檢出。術(shù)前化療后，PM變性，ALA熒光強(qiáng)度下降。光敏化PpIX在腫瘤中特異性蓄積量與腫瘤類型有關(guān)，胃癌PM和闌尾黏液腺癌中PpIX含量顯著低于卵巢癌、胰腺癌和間皮瘤。

表4 不同原發(fā)部位PM中PpIX含量[8]Tab.4 PpIX contents in PM of different origins

PM: peritoneal metastasis;PpIX: protoporphyrin IX.

4 ALA PDD的安全性和可行性

口服ALA不良反應(yīng)罕見，因為ALA是固有分子，并能通過卟啉/亞鐵血紅素途徑快速代謝為PpIX和亞鐵血紅素[4, 8]。Yonemura等[8]報道，138例患者行ALA-PDD，均口服ALA 20 mg/kg，僅1例(0.7%)出現(xiàn)惡心和嘔吐。Kamp等[27]報道，術(shù)后轉(zhuǎn)氨酶和白細(xì)胞較術(shù)前無明顯變化。84例患者中，5例暴露于日光下，出現(xiàn)了短暫性紅斑。皮膚卟啉癥由于光毒性，表現(xiàn)為多種皮膚癥狀，ALA-PDD護(hù)理過程中應(yīng)避光。卟啉癥的診斷依靠檢測尿、全血和血漿中的卟啉相關(guān)代謝物，個別病例中需酶活性檢測和基因分析?；颊咴\斷急性卟啉癥后，應(yīng)立即給予大量葡萄糖靜脈滴注，靜脈注射血色素或亞鐵血紅素-精氨酸可有效改善臨床癥狀和異常卟啉代謝。此外，Yonemura等[8]報道ALA導(dǎo)航CRS術(shù)后合并癥發(fā)生率與常規(guī)CRS相似。

5 ALA-PDD與PM預(yù)后

Kamp等[27]在84例接受腦轉(zhuǎn)移ALA導(dǎo)航手術(shù)的患者中，分析了ALA誘發(fā)熒光狀態(tài)與局部復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。腦轉(zhuǎn)移手術(shù)切除后，5-ALA誘發(fā)熒光陽性可能為腦部局部進(jìn)展的危險因素。Guyotat等[28]系統(tǒng)研究了5-ALA導(dǎo)航技術(shù)在惡性腦膠質(zhì)瘤手術(shù)中的應(yīng)用，在52例回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，無熒光殘留和可疑熒光殘留組生存期顯著優(yōu)于熒光殘留組。進(jìn)一步的前瞻性研究顯示，ALA導(dǎo)航手術(shù)組無進(jìn)展生存期顯著優(yōu)于常規(guī)手術(shù)組，兩組總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Rink等[29]對44篇PDD在膀胱腫瘤中的應(yīng)用研究進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，PDD組與常規(guī)白光組相比，無復(fù)發(fā)生存期平均延長20%。Ushimaru等[30]對113例進(jìn)展期胃癌患者行腹腔鏡下ALA-PDD，發(fā)現(xiàn)ALA-PDD檢測腹膜轉(zhuǎn)移陽性患者3年生存期顯著低于陰性患者。此外，該研究顯示ALA-PDD診斷腹膜轉(zhuǎn)移陽性且肉眼診斷陰性的患者，經(jīng)新輔助化療加手術(shù)治療后，其生存情況與腹膜轉(zhuǎn)移陰性患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并顯著優(yōu)于ALA-PDD和肉眼同時診斷陽性患者。轉(zhuǎn)移灶周圍的部分無瘤組織有ALA衍生熒光，可能會導(dǎo)致無意識的根治性擴(kuò)大切除，ALA陽性轉(zhuǎn)移灶比ALA陰性轉(zhuǎn)移灶切除更徹底可能是延長患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期的原因之一。

在ALA陽性PM中，與常規(guī)明場下手術(shù)相比，ALA-PDD能提高徹底切除率，腹膜復(fù)發(fā)率可能下降。然而，在消化道腫瘤中，目前研究主要關(guān)注于PDD診斷PM靈敏度和特異度，目前尚無ALA熒光導(dǎo)航手術(shù)下，CRS術(shù)后熒光殘余狀態(tài)與復(fù)發(fā)及生存相關(guān)性的研究報道。

6 結(jié)語

ALA-PDD可檢測卵巢癌、胰腺癌、膽囊癌、小腸癌、結(jié)腸癌和間皮瘤來源的PM微小病灶，方法安全、可行，可發(fā)現(xiàn)明場下手術(shù)容易遺漏的隱匿PM或微小病灶。PEPT1和ABCG2基因同時表達(dá)，是PpIX癌組織內(nèi)蓄積的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。術(shù)前檢測PEPT1和ABCG2表達(dá)，可用于篩選適合ALA-PDD的患者。

ALA-PDD技術(shù)在隱匿PM或微小癌灶檢測方面優(yōu)勢明顯，但仍存在以下幾點不足：1)技術(shù)方法尚無規(guī)范，在給藥方式、檢測時間等方面無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；2)該技術(shù)與患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確；3)檢測深度不足，阻礙了該技術(shù)發(fā)展；4)背景組織自發(fā)熒光影響檢測靈敏度和特異度。

因此，ALA-PDD技術(shù)優(yōu)勢明顯，臨床應(yīng)用前景廣闊，亟需針對以上不足開展相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究。

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