基因編碼鈣指示劑在藥物反應(yīng)性細(xì)胞核鈣信號(hào)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)中的應(yīng)用

龔明濤 張晨光,2 丁 衛(wèi),2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100069; 2.腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，首都醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所， 北京 100069)

鈣離子是真核細(xì)胞內(nèi)最為重要的第二信使物質(zhì)之一，參與調(diào)控多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞的增生、分化、生長(zhǎng)、凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄和興奮性生理表型[1]。在神經(jīng)元等可興奮細(xì)胞中，細(xì)胞對(duì)核內(nèi)鈣離子濃度的變化十分敏感；并且細(xì)胞核鈣濃度的異常，與多種人類(lèi)疾病，特別是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系密切。有研究[2-3]表明，在阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥以及帕金森病的發(fā)生和進(jìn)展中均伴隨著細(xì)胞核鈣離子濃度在不同程度上的異常變化。近年來(lái)的研究[4]還陸續(xù)顯示，細(xì)胞核鈣離子還參與了對(duì)多種基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程，其中包括Atf3、Btg2、GADD45β、GADD45γ等一些重要的轉(zhuǎn)錄活化調(diào)控因子。

在活細(xì)胞水平對(duì)鈣離子的功能研究中，鈣指示劑是必不可少的工具。傳統(tǒng)用于檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的化學(xué)指示劑有Fura2和Fluo3等[5-6]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新型的鈣離子指示劑——基因編碼鈣指示劑(genetically-encoded calcium indicators, GeCI)得到日益廣泛的應(yīng)用，并且以其出色的表現(xiàn)和獨(dú)特的功能和優(yōu)點(diǎn)受到研究者的青睞[7]。GeCI可以實(shí)現(xiàn)在體實(shí)驗(yàn)中對(duì)鈣離子的長(zhǎng)時(shí)程檢測(cè)和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并且還可以借助細(xì)胞器的特異性定位信號(hào)表征某些特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的鈣離子變化情況[7]。近幾年來(lái)對(duì)GeCI的不斷改進(jìn)部分彌補(bǔ)了其相對(duì)于化學(xué)合成鈣指示劑靈敏度偏低的不足。Chen等[8]所研發(fā)的GCaMP6屬于較新一代GeCI中的一種，其檢測(cè)靈敏度有很大提升，并且在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)更加穩(wěn)定。Qi等[9]將核質(zhì)蛋白(nucleoplasmin)的核定位序列(nuclear localization signal, NLS)以及一種紅色熒光蛋白(tdTomato)與GCaMP6s進(jìn)行融合，構(gòu)建出nuGCaMP6s-tdTomato重組質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，tdTomato作為非鈣離子敏感的表達(dá)熒光基團(tuán)，可作為校準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染效率和熒光漂白作用的內(nèi)參分子。

在本研究中，筆者將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到U87MG細(xì)胞和非興奮細(xì)胞HeLa細(xì)胞中，在青蒿素、過(guò)氧化氫以及Paxilline等藥物的作用下，核鈣離子均有明顯的增多。但不同的藥物作用以及在不同的細(xì)胞之間，其核鈣的變化情況有很大的區(qū)別。在腫瘤細(xì)胞中，異質(zhì)性是其一個(gè)重要的標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性與腫瘤的耐藥性有著至關(guān)重要的關(guān)系[10]。并且已有研究[10]表明細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reductive oxidative species，ROS)水平的增高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性有很大的影響。在低濃度ROS情況下，ROS可能作為促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性發(fā)生的重要信號(hào)分子[10]。深入研究腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，有助于分析和了解腫瘤產(chǎn)生的機(jī)制、演化規(guī)律，解釋腫瘤治療過(guò)程中出現(xiàn)不同適應(yīng)性表型的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

重組質(zhì)粒nuGCaMP6s-tdTomato由首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)系葉海虹教授饋贈(zèng)。分子克隆的載體為pcDNA3.1真核細(xì)胞基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。HeLa人宮頸癌細(xì)胞和U87MG人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑和藥物

新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；蕈青霉素(Paxilline)購(gòu)自英國(guó)Tocris生物科學(xué)公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞和U87MG細(xì)胞置于含10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天給細(xì)胞更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。HeLa細(xì)胞48 h傳代一次，U87MG細(xì)胞48～72 h傳代一次。

細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將1.5×105個(gè)HeLa細(xì)胞或2.5×105個(gè)U87MG細(xì)胞鋪板于35 mm共聚焦顯微鏡專(zhuān)用培養(yǎng)皿中。鋪板18 h后的細(xì)胞換無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基。將重組質(zhì)粒nuGCaMP6s-tdTomato與Lipofectamine 2000TM和DMEM培養(yǎng)基混合，靜置20 min，加入到換液后的細(xì)胞中，6 h之后給細(xì)胞換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。

1.2.2 轉(zhuǎn)盤(pán)熒光共聚焦鈣成像

將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒nuGCaMP6s-tdTomato 24 h后的細(xì)胞，置于轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡(UltraVIEW VoX)下每間隔約25 s進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光圖像采集。在成像過(guò)程中完成基線(xiàn)數(shù)據(jù)記錄后，加入青蒿素(ART，100 ng/mL)等藥物刺激細(xì)胞，分別記錄核鈣成像信號(hào)和內(nèi)參熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)分別為488 nm與560 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)區(qū)間相應(yīng)為490～550 nm與590～700 nm)。

1.2.3 熒光共聚焦鈣成像

HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞鋪板于放置有玻片的24孔板上。鋪板18 h后，細(xì)胞換無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行nuGCaMP6s-tdTomato質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h之后，向細(xì)胞中加入Hoechst進(jìn)行細(xì)胞核染色，20 min后棄去Hoechst染液，PBS清洗3次，每次5 min。將玻片置于加有封片劑的載玻片上固定。室溫靜置1 h后將玻片置于STED超高分辨率共聚焦顯微鏡(TCS SP8 STED)下觀察[激發(fā)波長(zhǎng)分別為488 nm與561 nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)為(520±30)nm與(650±35)nm]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

共聚焦鈣成像圖像使用Image J分析灰度值，再通過(guò)綠色熒光(GCaMP6s)與紅色熒光(tdTomato)的比值，繪制統(tǒng)計(jì)圖像。細(xì)胞核鈣的動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)通過(guò)自定制的EXCEL程序及其界面完成。將Image J取得的熒光灰度值置于Cluster V3.0軟件后，采用“complete linkage”選項(xiàng)的缺省參數(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果進(jìn)行的細(xì)胞分類(lèi)和統(tǒng)計(jì)過(guò)程采用K-mean算法由計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)完成。將所得的輸出文件導(dǎo)入JavaTreeView軟件中，根據(jù)可視化的顯示結(jié)果進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞分組和異質(zhì)性比較分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒Nu-GCaMP6s-tdTomato轉(zhuǎn)染后熒光觀察

脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒nuGCaMP6s-tdTomato(圖1A)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中24 h之后，將4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定的細(xì)胞樣本玻片置于STED超高分辨率共聚焦顯微鏡下進(jìn)行掃描成像(圖1B)?？梢?jiàn)紅色熒光蛋白tdTomato在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)并且特異定位在細(xì)胞核區(qū)域，與Hoechst染料復(fù)染的細(xì)胞核完全共定位；而GCaMP6s的熒光信號(hào)在未經(jīng)刺激的細(xì)胞很弱，甚至低于可檢測(cè)水平，表明在正常培養(yǎng)條件下細(xì)胞核內(nèi)的鈣離子濃度處于較低水平。將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后的未固定活細(xì)胞置于熒光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖1C)，在向共聚焦培養(yǎng)皿中加入Paxilline(10 μmol/L)后，可見(jiàn)HeLa細(xì)胞核內(nèi)的GCaMP6s熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，且濃度隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加，而tdTomato的紅色熒光強(qiáng)度除激光漂白作用略有下降基本保持穩(wěn)定。將GCaMP6s熒光強(qiáng)度與tdTomato熒光強(qiáng)度在去除基線(xiàn)本底信號(hào)后計(jì)算比值可用于細(xì)胞核鈣離子濃度的相對(duì)定量指示(圖1D)。

圖1 細(xì)胞核定位的GCaMP6s熒光信號(hào)經(jīng)tdTomato標(biāo)準(zhǔn)化后用于核鈣水平的定量分析Fig.1 Fluorescence signal of nuclei-localized GCaMP6s used for quantitative analysis ofnuclear calcium level after normalization with tdTomato

A: plasmid map of nuGCaMP6s-tdTomato;B: confocal imaging of HeLa cells after nuGCaMP6s-tdTomato transfection;C: real-time fluorescence imaging of HeLa cells with Paxilline treatment after nuGCaMP6s-tdTomato transfection;D: quantitative analyse of fluorescence intensity ratio between GCaMP6s and tdTomato in the same cell;NLS:nuclear localization sequence.

2.2 細(xì)胞內(nèi)在遺傳背景及外在環(huán)境刺激因素對(duì)核鈣信號(hào)的影響

在進(jìn)一步的研究中，筆者首先利用Paxilline給藥作為細(xì)胞核鈣信號(hào)的刺激條件，將重組GeCI質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞和U87MG細(xì)胞，以前述的規(guī)一化的綠色/紅色熒光強(qiáng)度比值為測(cè)量參數(shù)，觀察和比較了兩種細(xì)胞的反應(yīng)性動(dòng)態(tài)核鈣信號(hào)變化(圖2A、B)。結(jié)果顯示，在HeLa和U87MG細(xì)胞中均可檢測(cè)到在40 min記錄時(shí)程中細(xì)胞核鈣濃度的進(jìn)行性增加，且增加的幅度相對(duì)比較接近，以HeLa細(xì)胞中的數(shù)值略高。然而，在兩種細(xì)胞中，核鈣增加的動(dòng)力學(xué)模式則存在顯著的差別。在HeLa細(xì)胞組中，快速增加的時(shí)相從700 s起開(kāi)始出現(xiàn)，呈漸進(jìn)性；而在U87MG細(xì)胞中，核鈣的迅速增加從150 s左右已經(jīng)開(kāi)始，并且較快達(dá)到平臺(tái)峰值。表明細(xì)胞內(nèi)在環(huán)境，即主要由遺傳背景所決定基因表達(dá)核穩(wěn)態(tài)差異，能夠顯著影響細(xì)胞核鈣水平對(duì)外界刺激的反應(yīng)性。

此外，為了探索一些具有生物活性的化合物是否能夠引起類(lèi)似Paxilline的核鈣刺激反應(yīng)，筆者在經(jīng)過(guò)nuGCaMP6s-tdTomato轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)中，即時(shí)加入不同的藥物并觀測(cè)活細(xì)胞核鈣水平的動(dòng)態(tài)變化。研究ART同樣能夠?qū)е录?xì)胞核鈣的持續(xù)增加(圖2C)。在HeLa細(xì)胞中與Paxilline的作用有類(lèi)似之處，存在約600 s的緩慢上升的滯后時(shí)段；但是增加的幅度較小，約為1/4左右。ART引起的核鈣變化與H2O2的作用明顯不同，其核鈣的反應(yīng)性增加更為強(qiáng)烈且持續(xù)；而同時(shí)通過(guò)圖中所顯示較大的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤，可潛在提示出細(xì)胞對(duì)H2O2的刺激反應(yīng)存在一定的異質(zhì)性(圖2D)。為排除加藥或記錄等操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞刺激所引起細(xì)胞核鈣變化的可能性，筆者使用了多種藥物的溶劑DMSO作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于細(xì)胞核鈣離子沒(méi)有明顯的影響(圖2E)。

圖2 細(xì)胞內(nèi)在遺傳背景及外在環(huán)境刺激因素對(duì)核鈣信號(hào)的影響Fig.2 Effect of genetic background and external environmental stimuli on nuclear calcium signal

A: real time nuclear calcium signal profiles of HeLa cells treated with Paxilline(50 μmol/mL);B: real time nuclear calcium signal profiles of U87MG cell treated with Paxilline;C-E: real time nuclear calcium signal profiles of HeLa cell treated with ART(artemisinin) (100 μg/mL), H2O2(100 μmol/mL) and 10% DMSO.

2.3 U87MG細(xì)胞中核鈣水平的變化可反映對(duì)外界刺激應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)的異質(zhì)性

為進(jìn)一步觀察細(xì)胞在受到應(yīng)激刺激后是否具有異質(zhì)性的反應(yīng)，筆者在GeCI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的U87MG細(xì)胞給予Paxilline核鈣激動(dòng)之前，先期將其短期暴露于H2O2(100 μmol/L)中。在利用Image J軟件分析綠色紅色熒光灰度值并計(jì)算熒光比值的動(dòng)態(tài)變化之后，將獲得的數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入至Cluster V3.0和JavaTreeView軟件，進(jìn)行U87MG細(xì)胞異質(zhì)性表現(xiàn)的聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)。在圖3中可見(jiàn)，受到H2O2應(yīng)激刺激后，U87MG細(xì)胞的表現(xiàn)大致被分為3類(lèi)?？梢?jiàn)大部分(68.2%)細(xì)胞的核鈣曲線(xiàn)與圖2中未經(jīng)H2O2處理的情況較為類(lèi)似，但核鈣離子的增加在初始時(shí)更為迅速。另分別有約13%和18%的細(xì)胞則表現(xiàn)出顯著不同特征，前者在后期出現(xiàn)鈣信號(hào)的變異較大，呈持續(xù)上升，后者在一過(guò)性的峰值過(guò)后，鈣離子濃度恢復(fù)至穩(wěn)定的較低水平。

圖3 過(guò)氧化氫處理引發(fā)U87MG細(xì)胞Paxilline反應(yīng)性核鈣變化的異質(zhì)性表現(xiàn)Fig.3 Heterogeneity of nuclear calcium alteration in U87MG cells with sequential treatment of H2O2 and Paxilline

U87MG cells were first transfected with nuGCaMP6s-tdTomato, and 24 h later, were treated with H2O2(100 μmol/mL) for 5 minutes, followed with Paxilline(50 μmol/mL) stimulation. The dynamics of the nuclear calcium alteration were recorded.

3 討論

在興奮細(xì)胞的研究中，鈣離子及其多樣性的生物學(xué)研究一直受到較多的重視。近些年來(lái)，細(xì)胞核鈣濃度的變化逐漸引起人們的關(guān)注，并且已被證實(shí)與諸多的基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系密切[11]，但是就總體而言，關(guān)于核鈣功能的研究仍然很不充分，而在非興奮性細(xì)胞研究中更為缺少[12]。傳統(tǒng)用于鈣離子研究的指示劑通常屬于化學(xué)合成的指示劑，如Fura2、Fluo3等，但是這些指示劑并不能滿(mǎn)足細(xì)胞核鈣研究的要求，在使用中常常受到許多胞質(zhì)因素的干擾[11]。新型GeCI在許多領(lǐng)域的研究中優(yōu)勢(shì)顯著，特別是以GCaMP6為基礎(chǔ)的改進(jìn)型分子。GCaMP6分為GCaMP6f和GCaMP6s兩種，相較于GCaMP6f，GCaMP6s藥代動(dòng)力學(xué)緩慢，在細(xì)胞內(nèi)可以長(zhǎng)時(shí)間存在，更加耐受熒光的激發(fā)漂白作用。本課題中為適應(yīng)非興奮性細(xì)胞模型所使用的GCaMP6s指示劑，不僅檢測(cè)靈敏，而且由于NLS的存在，可以直接將指示劑定位到細(xì)胞核，基本上排除了胞質(zhì)鈣離子等因素的干擾。再通過(guò)綠色熒光(GCaMP6s)和紅色熒光(tdTomato)的灰度比值，可以更準(zhǔn)確和迅速地檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)鈣離子的變化情況。

在本研究中，筆者構(gòu)建了可用于細(xì)胞核鈣水平動(dòng)態(tài)分析的鈣指示劑載體，并且建立和完善了相應(yīng)的定量指標(biāo)與技術(shù)流程。應(yīng)用此方法不僅可以比較不同遺傳背景細(xì)胞系之間的核鈣調(diào)控差異性，而且可以快速簡(jiǎn)便地篩選各種可引起細(xì)胞核鈣濃度改變的天然及合成化合物。據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，青蒿素具有抗炎、抗癌以及改變細(xì)胞內(nèi)包括酸堿度和其他多種代謝物豐度的生物學(xué)活性，參與其作用機(jī)制的信號(hào)途徑之一是PI3K相關(guān)的細(xì)胞鈣離子第二信使介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。盡管ART能否直接引起細(xì)胞核鈣濃度的變化此前尚無(wú)報(bào)道，但鑒于細(xì)胞核鈣與細(xì)胞質(zhì)鈣離子的水平變化往往呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性，本研究所發(fā)現(xiàn)的ART刺激后的核鈣離子濃度增加現(xiàn)象也并非完全意外的結(jié)果[15]。此外，本研究的結(jié)果還表明，核鈣對(duì)外界刺激的反應(yīng)性的分析可以用于揭示細(xì)胞生命過(guò)程中存在的功能異質(zhì)性。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，細(xì)胞異質(zhì)性的研究也是腫瘤研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域[16]。在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次分裂增生，細(xì)胞異質(zhì)性可能在遺傳、環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)過(guò)程等許多層面參與腫瘤細(xì)胞表型的決定[17]，而對(duì)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的研究在癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移機(jī)制研究、以及腫瘤的治療和預(yù)后方面有著重要的意義[16，18-19]。通過(guò)比較不同的細(xì)胞在相同藥物刺激下或某種細(xì)胞在不同的藥物刺激下核鈣離子變化的情況，可以作為細(xì)胞行為或細(xì)胞改變的最初功能性檢測(cè)指標(biāo)；同時(shí)細(xì)胞在接受刺激后核鈣變化的異質(zhì)性表現(xiàn)也可能成為細(xì)胞分類(lèi)或分選的依據(jù)，這一不依賴(lài)于基因檢測(cè)的策略具有與其他組學(xué)分析方法所不同的快速、及時(shí)和動(dòng)態(tài)特點(diǎn)，并且具有和組學(xué)研究互補(bǔ)結(jié)合的可能性，在實(shí)際應(yīng)用中將會(huì)展示極大的潛力。例如，通過(guò)此方法進(jìn)行大量藥物的篩選，可以幫助歸類(lèi)藥物的適宜靶向細(xì)胞類(lèi)型，提示藥物間作用機(jī)制的共性與差異，或者優(yōu)化藥物作用劑量、組合或溶劑/劑型等。

關(guān)于細(xì)胞核鈣離子的來(lái)源問(wèn)題，在神經(jīng)元中被認(rèn)為是從細(xì)胞雙層核膜中釋放進(jìn)入胞核[20]。由于細(xì)胞核膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在連通，因而可能更多受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度變化的影響。當(dāng)細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞時(shí)[21]，也有可能部分進(jìn)入到細(xì)胞核，但其快速和脈沖式的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)似乎與本研究中所見(jiàn)的核鈣緩慢且持續(xù)性的增加不甚一致。當(dāng)然是否也存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放到胞質(zhì)后，再進(jìn)入到細(xì)胞核的情況，需要在一些特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行后續(xù)的探討。關(guān)于細(xì)胞核鈣的變化與細(xì)胞核膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的關(guān)系，在本研究所發(fā)現(xiàn)和描述的現(xiàn)象中得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持，這也進(jìn)一步提示了細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下，特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞核鈣水平的改變對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持可能具有重要的生理和病理意義。

盡管越來(lái)越多的研究[22]開(kāi)始涉及核鈣離子對(duì)細(xì)胞的影響，但是關(guān)于核鈣離子生物學(xué)意義和作用機(jī)制的一些關(guān)鍵問(wèn)題尚未解決。在神經(jīng)細(xì)胞中，已有研究[23-25]表明鈣離子受到一些激酶和膜通道分子的調(diào)控，可以通過(guò)核孔復(fù)合物(nuclear pore complex, NPC)進(jìn)入到細(xì)胞核。在非可興奮細(xì)胞中，核內(nèi)鈣離子是否存在不同的調(diào)控機(jī)制或影響因素，并且如何影響甚至改變細(xì)胞的非興奮性表型，此類(lèi)重要的科學(xué)問(wèn)題的解決需要對(duì)細(xì)胞核鈣離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和細(xì)致的描述，本研究恰恰為此提供了幫助。但是本研究尚未能夠?qū)?xì)胞核鈣的動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)和描述參數(shù)提供確切的生物學(xué)意義詮釋?zhuān)@是需要在今后的研究和應(yīng)用中力圖解決的迫切問(wèn)題。

此外，本研究所用的技術(shù)方法在今后的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中還存在持續(xù)獲得優(yōu)化和改良的空間，具體的改進(jìn)可包括如下方面：1)延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)程，如果能夠達(dá)到6 h以上則可以隨著部分基因轉(zhuǎn)錄和編碼蛋白表達(dá)的完成，得到更加豐富和具有提示意義的信息；2)考慮在提高系統(tǒng)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，嘗試藥物或刺激因素的組合，如此可使得本方法具有多種電生理實(shí)驗(yàn)的特征，通過(guò)特異性激動(dòng)劑或阻斷劑的聯(lián)合或組合使用，進(jìn)行相關(guān)因素的解析或因果關(guān)系的研判；3)增加分析能力和通量，本研究具備單細(xì)胞分析的特征，可以與多種高內(nèi)涵或微流控分析設(shè)備的軟硬件系統(tǒng)結(jié)合使用，同時(shí)所記錄的數(shù)據(jù)也能夠自然形成大數(shù)據(jù)分析中的一個(gè)特殊層面，成為與形態(tài)學(xué)和組學(xué)分析相互補(bǔ)的直接功能性指標(biāo)。4)追蹤和保持與新型載體和熒光指示劑在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中的及時(shí)更新，包括病毒載體和與在體實(shí)驗(yàn)熒光檢測(cè)裝備結(jié)合應(yīng)用的可能性，同時(shí)隨著更敏感的GeCI的研發(fā)和使用，本研究所創(chuàng)建的技術(shù)方法在核鈣信號(hào)研究中的推廣和應(yīng)用將能夠取得更加令人矚目的結(jié)果和發(fā)現(xiàn)。

致謝：感謝首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院仇峰博士提供本研究所使用的研究級(jí)青蒿素試劑。

[1] Clapham D E. Calcium signaling[J]. Cell,2007,131(6):1047-1058.

[2] Reddy K, Cusack C L, Nnah I C, et al. Dysregulation of nutrient sensing and CLEARance in presenilin deficiency[J]. Cell Rep,2016,14(9):2166-2179.

[3] Pchitskaya E, Popugaeva E, Bezprozvanny I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases[J]. Cell Calcium,2017，70：87-94.

[4] Zhang S J, Zou M, Lu L, et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity[J]. PLoS Genet,2009,5(8):e1000604.

[5] Al Mamun Bhuyan A, Nussle S, Cao H, et al. Simvastatin, a novel stimulator of eryptosis, the suicidal erythrocyte death[J]. Cell Physiol Biochem,2017,43(2):492-506.

[6] Rabenstein M, Peter F, Joost S, et al. Decreased calcium flux in Niemann-Pick type C1 patient-specific iPSC-derived neurons due to higher amount of calcium-impermeable AMPA receptors[J]. Mol Cell Neurosci,2017,83:27-36.

[7] Rose T, Goltstein P M, Portugues R, et al. Putting a finishing touch on GECIs[J]. Front Mol Neurosci,2014,7:88.

[8] Chen T W, Wardill T J, Sun Y, et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity[J]. Nature,2013,499(7458):295-300.

[9] Qi T, Yang H Q, Fan X X, et al. Engineering of GCaMP6-based calcium indicators for nuclear calcium imaging[J]. Chin J Bio Molecul Biol,2015,31(6):592-598.

[10] de Sa Junior P L, Camara D, Porcacchia A S, et al. The roles of ROS in cancer heterogeneity and therapy[J]. Oxid Med Cell Longev,2017,2017:2467940.

[11] Bengtson C P, Bading H. Nuclear calcium signaling[J]. Adv Exp Med Biol,2012,970:377-405.

[12] Bading H. Nuclear calcium signalling in the regulation of brain function[J]. Nat Rev Neurosci,2013,14(9):593-608.

[13] Wei T, Liu J. Anti-angiogenic properties of artemisinin derivatives (Review)[J]. Int J Mol Med,2017,40(4):972-978.

[14] Mbengue A, Bhattacharjee S, Pandharkar T, et al. A molecular mechanism of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria[J]. Nature,2015,520(7549):683-687.

[15] Qiao G, Li S, Yang B, et al. Inhibitory effects of artemisinin on voltage-gated ion channels in intact nodose ganglion neurones of adult rats[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2007,100(4):217-224.

[16] Koren S, Bentires-Alj M. Breast tumor heterogeneity: source of fitness, hurdle for therapy[J]. Mol Cell,2015,60(4):537-546.

[17] Meacham C E, Morrison S J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity[J]. Nature,2013,501(7467):328-337.

[18] 徐晨，王玉，李昕頔，等.外周血miR-378表達(dá)對(duì)腫瘤診斷價(jià)值系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22(10)：809-813,818.

[19] 張蒙，吳松，蔡志明.腎細(xì)胞癌異質(zhì)性與個(gè)性化醫(yī)療現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22(15)：1249-1252.

[20] Bootman M D, Fearnley C, Smyrnias I, et al. An update on nuclear calcium signalling[J]. J Cell Sci,2009,122(Pt 14):2337-2350.

[21] Purali N. Fast calcium transients translate the distribution and conduction of neural activity in different regions of a single sensory neuron[J]. Invert Neurosci,2017,17(3):7.

[22] Zhang S J, Zou M, Lu L, et al. Nudear Calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity[J]. PLoS Genet, 2009,5(8): e1000604.

[23] Eder A, Bading H. Calcium signals can freely cross the nuclear envelope in hippocampal neurons: somatic calcium increases generate nuclear calcium transients[J]. BMC Neurosci,2007,8:57.

[24] Allbritton N L, Oancea E, Kuhn M A, et al. Source of nuclear calcium signals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91(26):12458-12462.

[25] Brini M, Marsault R, Bastianutto C, et al. Nuclear targeting of aequorin. A new approach for measuring nuclear Ca2+concentration in intact cells[J]. Cell Calcium,1994,16(4):259-268.