重癥急性胰腺炎患者外周血NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)研究

劉文平 ，謝勇 ，諸葛雅麗

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006；2、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西 南昌330006；3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化研究所，江西 南昌330006)

重癥急性胰腺炎 （severe acute pancreatitis，SAP）是消化系統(tǒng)危重癥疾病，病程進(jìn)展快，患者早期即可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合癥（systemtic inflammatory response syndrome，SIRS），繼而發(fā)展為多器官功能障礙綜合癥 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS），病死率高達(dá) 20%～30%[1]。目前越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為抗炎－抑炎平衡紊亂致使機(jī)體不足以拮抗過(guò)度的炎癥是重癥急性胰腺炎發(fā)生的核心問(wèn)題[2]。 自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗感染、抗腫瘤及移植排斥中起著十分重要的作用，其中NK細(xì)胞在SAP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用也逐漸引起了人們的關(guān)注。

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子3（T cell immunoglobulin－and mucin－domain－containing molecule－3，Tim－3）是 Tim 基因家族中的一個(gè)重要成員，是一個(gè)具有多種生物學(xué)功能的免疫調(diào)節(jié)分子[3]。Tim－3可通過(guò)與其配體Galectin－9結(jié)合可特異性誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，從而負(fù)向調(diào)控Th1反應(yīng)，是一種在T細(xì)胞耐受、自身免疫、慢性感染中有重要作用的負(fù)性共刺激分子[4]。近年研究證實(shí)，Tim－3可調(diào)控NK細(xì)胞的功能，參與機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程[5]。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)SAP患者外周血NK細(xì)胞上Tim－3表達(dá)的報(bào)道。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SAP患者和健康志愿者外周血NK細(xì)胞表面Tim－3分子表達(dá)情況，初步探討NK細(xì)胞上的Tim－3在SAP發(fā)生發(fā)展中的免疫學(xué)作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年6月至2017年6月收治的62例初診SAP為研究對(duì)象，其中男38例，女24例，年齡22～80歲，中位年齡53歲。SAP患者均未進(jìn)行過(guò)抗炎治療、放療、化療、中西醫(yī)結(jié)合治療及生物治療，且無(wú)合并其他腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病等。健康對(duì)照組為同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院對(duì)照中心性別、年齡匹配的25例健康體檢者，其中男17例，女8例，年齡25～76歲，中位年齡51歲，所有健康對(duì)照者既往體檢，無(wú)感染性疾病及自身免疫性疾病等。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和設(shè)備 抗人 Tim－3－PE、CD－56－PECy5、CD3－FITC、IgG1－PE 抗體均購(gòu)自美國(guó) eBioscience公司，人外周血溶血素購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Cytomics FC 500型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本的收集 SAP患者入院第2d清晨空腹抽取抗凝靜脈血，健康對(duì)照者對(duì)照當(dāng)天清晨空腹抽取抗凝靜脈血?？鼓o脈血標(biāo)本完成臨床檢測(cè)后當(dāng)天進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞上Tim－3的表達(dá)抗凝靜脈血用密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC），PBMC采用200μl PBS重懸備用，每個(gè)流式管加入50μl細(xì)胞懸液，對(duì)照管加入 CD3－FITC、CD56－PECy5、IgGl－PE 各 5μl；測(cè)定管依次加入 CD3－FITC、CD56－PE－Cy5、Tim 3－PE 各 5μl， 室溫避光溫育15min， 加 PBS 2ml混勻，1500r/min 離心 5min，重復(fù)洗2次后棄上清液，加入PBS 500μl重懸細(xì)胞。將重懸的細(xì)胞避光上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后采用Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀軟件對(duì) NK （CD3－CD56+）細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以 Kolmogorov－Smirnov檢驗(yàn)（K－S 檢驗(yàn)）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù) （上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）表示，兩組間資料數(shù)據(jù)比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAP患者外周血NK細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 SAP患者與健康對(duì)照者外周血NK細(xì)胞占PBMC比例分別為（6.01±3.75）%和（12.51±3.41）%，SAP 患者外周血NK細(xì)胞占PBMC比例較健康對(duì)照者顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.50，P＜0.01），見(jiàn)圖 1。

2.2 SAP患者外周血NK細(xì)胞上Tim－3的表達(dá)情況 SAP患者與健康對(duì)照者外周血NK細(xì)胞上Tim－3 表達(dá)水平分別為 [23.25 （9.63，44.33）]%和[9.60 （5.05，11.25）]%，SAP 患者外周血 NK 細(xì)胞上Tim－3表達(dá)水平較健康對(duì)照者顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=362.50，P＜0.01），見(jiàn)圖 2。

3 討論

NK細(xì)胞是抵抗病原體的固有免疫反應(yīng)的第一道防線，具有多種生物學(xué)功能，除分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮直接抗感染外，NK細(xì)胞可與靶細(xì)胞密切接觸，通過(guò)多種途徑發(fā)揮殺傷效應(yīng)。此外，NK細(xì)胞還通過(guò)殺傷未成熟DCs、活化CD4+T細(xì)胞及超活化巨噬細(xì)胞等，進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，降低發(fā)生免疫紊亂風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，NK細(xì)胞不僅對(duì)機(jī)體感染微生物有很好防御作用，也可防止由于微生物感染導(dǎo)致的過(guò)度免疫應(yīng)答[7]。目前，關(guān)于SAP患者外周血NK細(xì)胞的比例研究較少，本研究表明SAP患者外周血NK細(xì)胞比例與健康者相比顯著降低，低數(shù)量的NK細(xì)胞可能對(duì)機(jī)體的免疫防御功能有影響，使其不能有效發(fā)揮抗感染作用。

NK細(xì)胞的殺傷功能主要依賴于活化性受體與抑制性受體之間的相互平衡[8]。近年研究證實(shí)，NK細(xì)胞表面不僅表達(dá)活化性受體和抑制性受體，也表達(dá)著共刺激分子，其中負(fù)性共刺激分子是現(xiàn)今NK細(xì)胞功能研究的熱點(diǎn)[9]。Tim-3是機(jī)體中重要的負(fù)性共刺激分子，在T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均有表達(dá)[10]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)Tim-3在NK細(xì)胞也有表達(dá)，可調(diào)控NK細(xì)胞的功能，在感染性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[11]。如，在慢性乙肝感染過(guò)程中，NK細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)顯著升高，且Tim-3負(fù)性調(diào)控患者NK細(xì)胞的活性，導(dǎo)致NK細(xì)胞功能抑制，阻斷Tim-3通路后可恢復(fù)NK功能[12]。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核病患者中，外周血NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)升高，阻斷Tim-3通路后可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)結(jié)核菌的殺菌能力和抗原提呈功能。在腫瘤研究領(lǐng)域，Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者Tim-3的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照，在發(fā)生轉(zhuǎn)移或臨床分期晚的胃癌患者，NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平則更高，提示Tim-3在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定作用。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)62例初診SAP患者及25例健康對(duì)照者外周血NK細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP患者NK細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)的陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照者，提示，Tim-3可能參與了SAP患者NK細(xì)胞功能的調(diào)控。由于本研究樣本數(shù)較少，今后我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入探討SAP患者Tim-3對(duì)NK細(xì)胞的功能影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在SAP患者外周血NK細(xì)胞上表達(dá)顯著升高。進(jìn)一步探究Tim-3在SAP中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，或?qū)镾AP的診治提供新的靶點(diǎn)。

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