桃花中綠原酸抗氧化活性的研究△

梁萱，李嘉會(huì)，梁永鋒*

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 固原 756000)

桃花Prunuspersica是薔薇科落葉喬木桃樹的花，是一種民間常用中藥。主治水腫，痰飲，腳氣，便秘，利水通便，癲狂，閉經(jīng)，瘡疹等[1]。研究表明桃花中含有山奈酚、多糖、黃酮、綠原酸、維生素、蛋白質(zhì)等多種對人體有益的活性成分[2-3]。綠原酸具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抑制癌細(xì)胞突變、抗腫瘤、保護(hù)心血管、降低血壓等藥理作用[4-5]。自由基是人體代謝的產(chǎn)物，主要以超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫自由基等形式存在于人體內(nèi)，人體中過多的自由基會(huì)破壞細(xì)胞膜，使血清抗蛋白酶失去活性，損傷基因?qū)е录?xì)胞變異的出現(xiàn)和蓄積。大量資料已經(jīng)證明，炎癥，腫瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮膚等100多種疾病的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系[6-7]。用人工合成的抗氧化劑來消除體內(nèi)的自由基和治療疾病，往往效果不佳，且產(chǎn)生毒副作用，因此，近年來關(guān)于中草藥的抗氧化活性研究越來越引起自由基醫(yī)學(xué)的重視[8-9]。但目前關(guān)于桃花提取物抗氧化活性的報(bào)道比較少，本實(shí)驗(yàn)通過近年來普遍采用的中藥抗氧化活性評價(jià)方法DPPH自由基法， D-脫氧核糖-鐵體系法和鄰苯三酚自氧化法[10]對桃花提取物的抗氧化活性與其綠原酸含量的相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究桃花的藥理作用提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

FW-177中草藥粉碎機(jī)；LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津)；UV-1750型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；XH300A微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；ME2358電子分析天平(德國塞多利斯公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮升華儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-200413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)；桃花(采自于寧夏固原市原州區(qū)寧夏師范學(xué)院后山古雁嶺)，將新鮮的桃花用蒸餾水清洗后，瀝干，放入恒溫箱中，在60 ℃烘干至恒重，自然涼干，粉碎，過80目篩，作為實(shí)驗(yàn)用樣品，備用。乙腈(色譜純)、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigme公司)、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸、鄰苯三酚、三氯乙酸、氫氧化鉀、無水乙醇、水楊酸、抗壞血酸、硫代巴比妥酸(TBA)、EDTA、乙酸乙酯、正己烷、FeCl3、H2O2、FeSO4等均為國內(nèi)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桃花中綠原酸的提取及含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.3%H3PO4水溶液(8∶92)為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1，保持30 ℃柱溫，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長331 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確稱取經(jīng)過干燥的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，乙醇溶解并定容至100 mL，配制成20 μg·mL-1的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別取1、2、5、10、15 μL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，以峰值面積值(Y)對綠原酸濃度(X)進(jìn)行限行回歸，回歸方程為：Y=11 367.62X-374.93，r=0.999 4，表明綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在20～300 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.3 桃花中綠原酸的提取及純化 根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，稱取10 g經(jīng)過預(yù)處理的桃花樣品于500 mL錐形瓶中，用200 mL 70%的乙醇浸潤30 min，在功率為70 W下超聲輻射75 min，過濾，將濾液收集，相同條件下再提取1次，將2次濾液合并。將濾液在60 ℃下減壓濃縮干燥，得到綠原酸粗提物0.499 6 g。將綠原酸粗品用蒸餾水完全溶解，用鹽酸調(diào)至pH值為3，用等體積的乙酸乙酯錯(cuò)流萃取，每次萃取10 min，連續(xù)萃取3次，合并萃取液上層，減壓濃縮至一定體積，按體積的40%加入正己烷，反復(fù)震蕩，將經(jīng)過分相析出的綠原酸在0～4 ℃結(jié)晶24 h，并將其在95 Kpa，50 ℃進(jìn)行真空干燥30 min，得到白色晶體綠原酸[11]，備用。

2.1.4 桃花提取的綠原酸含量的測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g桃花提取物綠原酸純化品，用70%的乙醇溶解并容至100 mL，配置成桃花提去物樣品溶液。取其樣品溶液1.00 mL，用乙醇稀釋定容至100 mL，按2.1.2方法測定。依據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其濃度，按公式：綠原酸的含量(%)=桃花提取物樣品溶液的體積(mL)×根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的濃度(μg·mL-1)×稀釋的倍數(shù)/桃花提取物質(zhì)量(g)×100%，計(jì)算得到桃花提取物中綠原酸含量為89.37%。

2.2 桃花提取物還原能力的測定

采用普魯士蘭法。取2.5 mL的不同濃度桃花提取物樣品(空白用蒸餾水代替，其他試劑下同)溶液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1，pH=6.6)及1%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，取反應(yīng)液5 mL。加入5 mL的H2O和0.10%的FeCl3溶液1 mL，混合均勻，10 min后于700 nm處測定其吸光度值[12]，以水為空白，吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。以相同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和抗壞血酸作陽性對照實(shí)驗(yàn)。

2.3 桃花提取物清除羥基自由基(·OH)的活性研究

采用D-脫氧核糖-鐵體系法。向干燥潔凈的試管中依次加入0.4 mL 50 mmol·L-1的KH2PO4-KOH緩沖液，一定濃度的桃花提取物樣品溶液，0.1 mL 1.04 mmol·L-1的EDTA溶液，0.1 mL 20 mmol·L-1的FeCl3溶液，0.1 mL10 mmol·L-1的H2O2， 0.1 mL 60 mmol·L-1的DR(其中對照不加)，0.1 mL 20 mmol·L-1的抗壞血酸，使反應(yīng)體系最終體積為1 mL， 37 ℃下保溫1 h，取出迅速加入25%的鹽酸1 mL終止反應(yīng)，再加入1 mL 1%的TBA，沸水煮沸15 min，立即冷卻，若有混濁加人3 mL正丁醇萃取，在532 nm下測其吸光度[13-14]，以相同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和抗壞血酸作陽性對照實(shí)驗(yàn)。清除率按以下公式計(jì)算：

(1)

其中A0：空白吸光度；A1：加入清除劑和DR 后吸光度；A2：樣品本身吸光度(不加DR)。

2.4 桃花提取物清除DPPH·自由基的活性研究

取不同濃度的桃花粗提物樣品溶液1 mL，向其中加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基無水乙醇溶液，常溫下黑暗處放置30 min，在517 nm下測得吸光值；以2 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液為空白組；2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH乙醇溶液與2 mL蒸餾水為對照組；同時(shí)以等體積蒸餾水和95%的乙醇混合液作為空白調(diào)零[15]。每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取吸光度的平均值，用相同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和抗壞血酸作陽性對照實(shí)驗(yàn)。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

(2)

式中A0：為對照組吸光度，Ay：為空白組吸光度，Ax：為加入桃花多糖后溶液的吸光度。

2.5 桃花提取物清除超氧陰離子的活性研究

(3)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桃花提取物的還原能力

稱取桃花提取物樣品20 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL，桃花提取物樣品的濃度為2 mg·mL-1，準(zhǔn)確移去該溶液1 mL，分別稀釋10、25、40、100、200、400倍，使桃花提取物樣品的濃度分別為200、100、50、20、10、5 μg·mL-1。按2.2方法分別測定桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和抗壞血酸的吸光度。用吸光度值的大小評價(jià)其還原能力，吸光度值越大還原能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 Vc、綠原酸和桃花提取物還原能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)選取的濃度范圍內(nèi)，Vc、桃花提取物和綠原酸對Fe3+具有還原能力，濃度小于20 μg·mL-1時(shí)還原能力均比較弱，但隨著濃度的增大其還原能力都迅速逐漸增強(qiáng)。且在濃度較低范圍內(nèi)Vc的還原能力明顯大于桃花提取物和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，當(dāng)濃度大于100 μg·mL-1時(shí)，隨著還原能力都在增強(qiáng)的同時(shí)三者的還原能力逐漸接近。

3.2 桃花提取物對羥基(·OH)自由基抗氧化活性

按2.3方法分別測定濃度為5、10、20、50、100、200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和Vc對D-脫氧核糖-鐵體系產(chǎn)生羥基自由基(·OH)的消除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3表明，在5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，桃花提取物、綠原酸和Vc對D-脫氧核糖-鐵體系產(chǎn)生的羥基(·OH)均有一定的抗氧化活性，相同濃度其抗氧化活性桃花提取物>綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品>抗壞血酸。而且隨著濃度的增大，抗氧化活性增大，當(dāng)濃度大于100 μg·mL-1抗氧化活性基本穩(wěn)定，濃度為200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和Vc的抗氧化活性分別為66.42%，49.92%和19.68%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)桃花提取物和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品對羥基自由基(·OH)抗氧化活性變化趨勢一致。

圖3 Vc、綠原酸和桃花提取物對·OH自由基抗氧化活性

3.3 桃花提取物對DPPH·自由基抗氧化活性

按2.4方法分別測定濃度為5、10、20、50、100、200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和Vc對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)產(chǎn)生的自由基抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4表明，在5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和Vc三種物質(zhì)對DPPH·自由基均具有強(qiáng)的抗氧化活性，隨著濃度的增大，其抗氧化活性增強(qiáng)。相同濃度下，桃花提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品對DPPH·自由基的抗氧化活性均大于Vc，濃度為200 μg·mL-1時(shí)其抗氧化活性分別為82.12%、78.42%和74.65%，且桃花提取物對DPPH·自由基的抗氧化活性具有良好的效量關(guān)系。

圖4 Vc、綠原酸和桃花提取物對DPPH·自由基

3.4 桃花提取物對超氧陰離子的抗氧化活性

圖5 Vc、綠原酸和桃花提取物對自由基抗氧化活性

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用體外化學(xué)模擬法對桃花綠原酸粗提物的抗氧化活性進(jìn)行了探討，并以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和抗壞血酸為對照，實(shí)驗(yàn)表明桃花提取物對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且與其濃度具有良好的效量關(guān)系，說明桃花中的抗氧化活性物質(zhì)主要來源于綠源酸。

由于植物成分的復(fù)雜性，往往含有多種抗氧化活性成分，因此，不同的提取方法、溶劑和條件將使成分、含量不同，導(dǎo)致評價(jià)效果產(chǎn)生差異。

體外化學(xué)模擬法與人體的抗氧化環(huán)境有所差異，關(guān)于桃花綠原酸能否作為人體抗氧化活性物質(zhì)還需要進(jìn)一步的探討和進(jìn)行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)研究。

關(guān)于桃花綠原酸抗氧化機(jī)理、抗氧化活性的穩(wěn)定性及桃花中其它抗氧化活性成分的協(xié)同作用需要繼續(xù)進(jìn)行探索和研究。

本實(shí)驗(yàn)只是對桃花提取物綠原酸的抗氧化活性進(jìn)行了初步探索，若要提高其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值還需要進(jìn)行大量深入的研究，可以預(yù)見桃花在醫(yī)療和美容領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

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