基于腸道菌群代謝的知母皂苷BⅡ體外代謝轉(zhuǎn)化研究

劉艷平 余自成 陳紅君

摘要：目的 通過大鼠腸道菌群體外實驗，觀察大鼠腸道菌群對知母皂苷BⅡ的代謝轉(zhuǎn)化情況。方法 收集大鼠新鮮糞便，將大鼠腸道菌加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液得到腸道菌孵育液，加入知母皂苷BⅡ，在厭氧環(huán)境中37 ℃溫孵24 h，經(jīng)沉淀離心，取上清液，采用高效液相色譜和薄層色譜方法對知母皂苷BⅡ降解情況和代謝成分進行分析。結(jié)果 知母皂苷BⅡ在大鼠糞便孵育液中很快發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，24 h后孵育液中已檢測不到知母皂苷BⅡ，能檢測出較高濃度的代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物經(jīng)檢測為知母皂苷AⅢ。結(jié)論 離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌可對知母皂苷BⅡ進行代謝，初步確定代謝產(chǎn)物為知母皂苷AⅢ。

關鍵詞：知母皂苷BⅡ；大鼠腸道菌；代謝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0066-05

Study on Metabolism and Transformation of Timosaponin BⅡ in Vitro

Based on Metabolism of Intestinal Flora

LIU Yan-ping1， YU Zi-cheng2， CHEN Hong-jun2

1. Pudong New Area Peoples Hospital， Shanghai 201200， China；

2. Yangpu Hospital of Tongji University， Shanghai 200090， China

Abstract： Objective To observe metabolic transformation of Timosaponin BⅡ in intestinal flora of rats by rat intestinal flora in vitro. Methods After the fresh rat feces were collected， the intestinal bacteria were added to the anaerobic medium to obtain the intestinal bacteria incubation fluid. Timosaponin BⅡ was added and cultured， and incubate at 37 ℃ in anaerobic environment for 24 h. Then samples were gathered through deposition and centrifugation. The supernatant was analyzed by HPLC and TLC method， and the degradation rate and metabolic components of Timosaponin BⅡ were analyzed. Results In vitro， Timosaponin BⅡ was metabolized by the intestinal flora soon and it could not be detected in the incubation fluid after 24 h， which could detect a higher concentration of metabolites. The metabolites preliminary identified as Timosaponin AⅢ. Conclusion Rat intestinal flora in vitro have metabolism effect on Timosaponin BⅡ. The metabolites are initially identified as Timosaponin AⅢ.

Keywords： Timosaponin BⅡ； intestinal bacteria； metabolize

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，味苦、性寒，具有清熱瀉火、止渴除煩、滋陰潤燥等功效，臨床用于高熱煩渴、外感熱病、內(nèi)熱消渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、腸燥便秘等。知母皂苷BⅡ（Timosaponin BⅡ，TBⅡ）是知母中的主要活性成分，具有抗老年癡呆、改善學習記憶、抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、降糖等藥理活性[1-2]。

基金項目：上海市楊浦區(qū)科技委衛(wèi)計委科研課題（YP15Q05）；同濟大學青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)行動計劃（2015KJ049）；上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院院級課題（Se1201509）

多種天然產(chǎn)物口服后可被腸道菌群代謝，有些天然產(chǎn)物經(jīng)腸道細菌代謝后轉(zhuǎn)化為具有更強活性藥理或毒理作用的新化合物，因此，許多天然藥物以前體藥形式存在，腸道菌群在其代謝中發(fā)揮著至關重要的作用。天然藥物代謝反應中最重要的是糖苷的水解，β-糖苷酶是催化這類反應的最常見水解酶，可以將外源性β-糖苷類化合物轉(zhuǎn)化為相應的苷元和糖。由于TBⅡ?qū)儆讦?糖苷類化合物（結(jié)構(gòu)見圖1），因此我們推測它可能會被腸道菌產(chǎn)生的β-糖苷酶代謝。本實驗采用離體腸道菌孵育的方法，將TBⅡ用大鼠腸道菌的培養(yǎng)液在厭氧條件下溫孵，考察其在腸道中代謝轉(zhuǎn)化的一般規(guī)律，以HPLC定性分析TBⅡ在大鼠腸道菌群中的代謝情況，并推測代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，探討TBⅡ在胃腸道內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化，以期為知母的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究及臨床應用開發(fā)提供依據(jù)。

圖1 TBⅡ結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（Agilent公司），Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器（美國Grace公司），MS204S梅特勒電子分析天平（北京梅特勒儀器系統(tǒng)有限公司），MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱（三洋電機株式會社），DK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），MTN-2800D氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），MSL-3780高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機株式會社），ALLEGRA X-30R離心機（Beckman Coulter）。

TBⅡ（批號B21657，純度≥98%），上海源葉生物有限公司；知母皂苷AⅢ（TAⅢ，批號17050329，純度≥98%），上海同田生物有限公司；厭氧培養(yǎng)液（批號20170613）、厭氧培養(yǎng)袋（批號20161225）、厭氧產(chǎn)氣包（批號20170615），上海哈靈生物公司；動物糞便采于SD雄性大鼠；乙腈（色譜純），美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 知母皂苷BⅡ色譜條件

色譜柱：AlltimaTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（25∶75）；流速：1 mL/min；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器，溫度為60 ℃，霧化氣體流速為1.5 L/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 知母皂苷AⅢ色譜條件

色譜柱：AlltimaTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（85∶15）；流速：1 mL/min；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器，溫度為60 ℃，霧化氣體流速為1.5 L/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤?/p>

精密稱取TBⅡ?qū)φ掌?7.6 mg，溶于30%丙酮溶液10 mL中，即配制成濃度為1.76 mg/mL的TBⅡ?qū)φ掌啡芤海糜? ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 知母皂苷AⅢ對照品溶液

精密稱取TAⅢ對照品12.1 mg，溶于10 mL甲醇溶液中，即配制成濃度為1.21 mg/mL的TAⅢ對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 厭氧培養(yǎng)液的制備

取GAM肉湯約15 g置燒杯中，加適量純水，水浴中攪拌使溶解，冷卻后轉(zhuǎn)移并定容至1000 mL容量瓶中，即得GAM培養(yǎng)液，0.07 MPa、121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后備用。

2.4 大鼠腸道菌孵育液的制備

取健康大鼠的新鮮糞便10 g，按質(zhì)量體積比1∶4加入生理鹽水制成混懸液，4000 r/min離心10 min，取上清液，得大鼠腸道菌液。將大鼠腸道菌液按體積比2∶3加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液中，混勻后即得大鼠腸道菌孵育液。

2.5 色譜方法的建立

2.5.1 線性關系考察

取1.628 mg/mL TBⅡ?qū)φ掌啡芤?，加入預先121 ℃高壓滅菌15 min的大鼠腸道菌孵育液中，逐級稀釋，分別配制濃度為40.7、108.5、407、814、1085、1628 μg/mL的對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果TBⅡ在40.7～1628 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的對數(shù)線性關系良好，回歸方程為Y=1.227 9X+0.635 5，r2=1。

2.5.2 專屬性考察

分別對空白腸道菌孵育液、TBⅡ?qū)φ掌啡芤汉蚑BⅡ腸道菌孵育液中待測成分的色譜專屬性進行考察分析，結(jié)果表明，TBⅡ?qū)φ掌啡芤汉蚑BⅡ腸道菌孵育液中TBⅡ的保留時間一致，空白腸道菌孵育液在相同保留時間無該色譜峰，空白腸道菌孵育液不干擾該成分的測定。色譜圖見圖2。

2.5.3 精密度試驗

取175.8 μg/mL的含預先121 ℃高壓滅菌15 min的腸道菌培養(yǎng)液的對照品溶液20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算峰面積RSD=1.72%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 加樣回收率試驗

取同一已知含量的121 ℃高壓滅菌15 min的含TBⅡ大鼠腸道菌培養(yǎng)液9份，分別每3份加入80%、100%、120%對照品溶液，測定TBⅡ含量，計算低、中、高3種濃度的加樣回收率分別為103%、105%、102.6%。

2.5.5 重復性試驗

取6份5 mL大鼠腸菌培養(yǎng)液，加入2 mL濃度為1.76 mg/mL的TBⅡ?qū)φ掌啡芤?，混勻，置?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，分別取出0.5 mL，加入0.5 mL冰乙腈終止反應，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，于37 ℃水浴上氮氣流吹干。殘渣用30%丙酮100 μL溶解，14 800 r/min離心15 min，取上清液，進行HPLC分析，測得TBⅡ含量RSD=2.48%。

A

B

C

注：A.TBⅡ?qū)φ掌?；B.空白腸道菌孵育液；C.TBⅡ腸道菌群孵育液

圖2 大鼠腸道菌孵育液中TBⅡ HPLC圖

2.6 知母皂苷BⅡ在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的代謝

取上述大鼠腸道菌孵育液5 mL，加入2 mL濃度為1.76 mg/mL的TBⅡ?qū)φ掌啡芤?，混勻，將溶液分裝（每管0.5 mL），同時設陰性對照組（不加TBⅡ的大鼠腸道菌孵育液，排除大鼠糞便中其他成分和厭氧培養(yǎng)液中成分的干擾）和空白對照組（TBⅡ?qū)φ掌啡芤?厭氧培養(yǎng)液，排除厭氧培養(yǎng)液對TBⅡ的干擾），每組重復2份。將各組置于培養(yǎng)系統(tǒng)中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱密閉培養(yǎng)0、1、2、4、8、12、24 h，于各時間點分別取出各樣品，加0.5 mL冰乙腈終止反應，渦旋振蕩1 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，置于氮吹儀上，37 ℃水浴氮氣流吹干。殘渣用30%丙酮100 μL溶解，14 800 r/min離心10 min，取上清液進樣分析，測定TBⅡ含量，計算TBⅡ的剩余率與轉(zhuǎn)化率。剩余率（%）=Cn÷C0×100%，轉(zhuǎn)化率（%）=（C0-Cn）÷C0×100%，式中Cn為第n個時間點的TBⅡ濃度，C0為0 h的TBⅡ濃度。另取一部分樣品殘渣，用甲醇100 μL溶解，14 800 r/min離心10 min，取上清液，進行HPLC和TLC分析，根據(jù)對照品初步鑒定代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 知母皂苷BⅡ在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的代謝轉(zhuǎn)化分析

TBⅡ在大鼠腸道菌孵育液中24 h的代謝情況見表1、圖3～圖5。厭氧培養(yǎng)液對TBⅡ的代謝轉(zhuǎn)化無影響，厭氧培養(yǎng)液與TBⅡ溫孵24 h含量基本不變，見圖6。大鼠糞便中其他物質(zhì)和厭氧培養(yǎng)液殘留成分也無干擾。TBⅡ在與大鼠腸道菌共孵育的過程中，代謝率的變化經(jīng)過了2個時期：急速增加期（0～8 h）、平穩(wěn)期（8～24 h）。TBⅡ與腸道菌共孵育24 h后已經(jīng)檢測不到TBⅡ。以0 h時TBⅡ的含量作為100%，TBⅡ在1、2、4、8、12、24 h的剩余率分別為70.4%、51.8%、34.8%、7.9%、3.2%、0%。以0 h時TBⅡ的代謝產(chǎn)物作為0%，TBⅡ在1、2、4、8、12、24 h的轉(zhuǎn)化率分別為29.6%、48.2%、65.2%、92.0%、96.8%、100%。

3.2 知母皂苷BⅡ在大鼠腸道菌孵育液中的代謝產(chǎn)物檢測

3.2.1 高效液相色譜檢測

采用HPLC檢測代謝產(chǎn)物是否為TAⅢ。分別精密吸取處理后的TBⅡ腸道菌孵育液與TAⅢ對照品溶液各20 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣，結(jié)果樣品圖譜中與對照品在相同的保留時間顯示同一個色譜峰，初步鑒定代謝產(chǎn)物為TAⅢ。各時間點HPLC圖見圖7。

3.2.2 薄層色譜檢測

將“2.6”項下的24 h孵育液迅速加入0.5 mL冰乙腈終止反應，渦旋振蕩2 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，于37 ℃水浴上氮氣流吹干。殘渣用100 μL甲醇溶解，14 800 r/min離心10 min，取上清液，進行薄層色譜分析。

分別吸取甲醇復溶的樣品溶液、TAⅢ對照品溶液和陰性對照溶液（不加TBⅡ的大鼠腸道菌孵育液）各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以CHCl3-MeOH-H2O（70∶15∶2）為展開劑展開，噴以香草醛硫酸試液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果樣品色譜中與對照品TAⅢ在相同位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照在相同位置上無相應斑點。由此可初步判斷代謝產(chǎn)物為TAⅢ。

4 討論

對于糖苷類成分而言，苷元是腸道菌群代謝的主要產(chǎn)物。本試驗中，大鼠腸道菌群對TBⅡ有較強的代謝作用，孵育8 h時轉(zhuǎn)化率即達到92%，24 h時已檢測不到TBⅡ，將代謝產(chǎn)物用甲醇復溶后可以檢測到濃度很高的TAⅢ；同時，薄層色譜鑒定顯示，樣品與對照品在相同位置上顯相同顏色的斑點。由此可以初步判定TBⅡ的大鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物為TAⅢ，即TBⅡ失去一分子糖，其可能的代謝途徑見圖8。

圖8 TBⅡ代謝途徑

中藥絕大多數(shù)通過口服吸收而發(fā)揮藥理作用，對于糖苷類藥物而言，通常在腸道內(nèi)很難吸收，生物利用度低，原型藥理活性小，需經(jīng)過腸道菌群的作用，發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化后發(fā)揮其藥理活性，被認為是“天然前體藥物”。近年來，關于TAⅢ抗腫瘤的研究報道很多，TAⅢ可以誘導人乳腺癌BT474及乳房上皮細胞MCF10A的凋亡[3]；能通過線粒體自我吞噬誘發(fā)HeLa癌細胞凋亡[4]，TAⅢ對黑色素瘤B16和A375、人腦膠質(zhì)瘤及人胰腺癌PANC-1細胞均具有凋亡作用[5-9]。King F W等[3]研究表明，TBⅡ無抗腫瘤活性，但TAⅢ能誘導多種腫瘤細胞凋亡，且對正常細胞無影響。本研究也比較了TBⅡ、TAⅢ兩者的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示TAⅢ對胰腺癌PANC-1細胞有較強的抑制作用，濃度為30 μg/mL時抑制率達97%?？梢?，TAⅢ具有較高的抗腫瘤藥理活性。然而，知母中TBⅡ含量較高，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定不少于3.0%，文獻報道最高達10.25%[10]；本研究測定結(jié)果顯示，TAⅢ含量較少，僅為TBⅡ的1/20。本研究結(jié)果表明，TBⅡ可較高效率地轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性更強的TAⅢ。這就提供了一種研究思路，即將TBⅡ在體外轉(zhuǎn)化為TAⅢ，本研究為體外大量制備TAⅢ提供了參考與技術支持。

TBⅡ易被大鼠腸道菌群代謝，掌握口服后其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，可為深入理解其藥理作用機制提供幫助，并且，其代謝產(chǎn)物TAⅢ的抗腫瘤藥理活性遠大于TBⅡ，將其活性代謝產(chǎn)物制成制劑入藥，是否能增加藥物的生物利用度和藥理活性，值得進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 徐愛娟，韓麗萍，蔣琳蘭.知母的研究進展[J].中藥材，2008，31（4）：624-628.

[2] 王迪，姜艷艷，石任兵.中藥知母質(zhì)量控制方法研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2011，34（4）：263-265.

[3] KING F W， FONG S， GRIFFIN C， et al. Timosaponin AⅢ is preferentially cytotoxic to tumor cells through inhibition of mTOR and induction of ER stress[J]. PLoS One，2009，4（9）：e7283.

[4] SY L K， YAN S C， LOK C N， et al. Timosaponin A-Ⅲ induces autophagy preceding mitochondria-mediated apoptosis in HeLa cancer cells[J]. Cancer Res，2008，68（24）：10229-10237.

[5] 潘會君，莫小輝，馮彥軍，等.知母皂苷AⅢ對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響[J].中國藥房，2014，25（43）：4049-4051.

[6] 潘會君，陳中建，章丹丹.知母皂苷AⅢ對2種黑色素瘤細胞生長及巨噬細胞活化的影響[J].中國藥師，2015，18（2）：181-185.

[7] 潘會君，史海霞，陳中建，等.知母皂苷AⅢ對黑色素瘤B16細胞生長和Bax，Bcl-2 mRNA的影響[J].中國新藥與臨床藥理，2015，26（1）：48-52.

[8] 潘會君，聶緒強，劉朵，等.4種中藥單體對人胰腺癌PANC-1細胞移植瘤生長的影響及分子機制探討[J].中國中藥雜志，2013，38（2）：245-248.

[9] 譚希，潘會君，吳偉達，等.知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質(zhì)瘤增殖生長的機制研究[J].中國中藥雜志，2017，42（6）：1160-1166.

[10] 梁雷，邊寶林，王宏潔.不同產(chǎn)地知母藥材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（16）：49-51.

（收稿日期：2017-11-03）

（修回日期：2017-12-25；編輯：陳靜）