HPLC測(cè)定百合中對(duì)香豆酸、沒食子酸含量

袁志鷹 劉湘丹 裴剛 周小江 黃惠勇 鄒歡

摘要：目的 建立藥食兩用植物百合中2種有效成分對(duì)香豆酸、沒食子酸的HPLC含量測(cè)定方法。方法 采用Hypersil BDC-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 ?m），對(duì)香豆酸的測(cè)定以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，沒食子酸的測(cè)定以甲醇-0.1%磷酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為310、270 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。結(jié)果 在上述色譜條件下，對(duì)香豆酸、沒食子酸與相鄰色譜峰之間分離度良好。對(duì)香豆酸線性回歸方程為Y=1×108X+57 335（r=0.998 7），線性范圍為10.00～160.03 ng；沒食子酸線性回歸方程為Y=3×107X-21 414（r=0.998 2），線性范圍為9.99～159.95 ng。對(duì)香豆酸、沒食子酸的平均回收率分別為95.63%、96.62%。結(jié)論 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、方便、可靠，可為百合飲片、百合藥膳產(chǎn)品開發(fā)及相關(guān)藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：卷丹百合；對(duì)香豆酸；沒食子酸；藥膳；含量測(cè)定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）05-0082-04

Contents Determination of P-coumaric Acid and Gallic Acid in Lilii Bulbus by HPLC

YUAN Zhi-ying1，2， LIU Xiang-dan1， PEI Gang1，2， ZHOU Xiao-jiang1，2， HUANG Hui-yong1， ZOU Huan3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Hunan Engineering Technology Center of Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha 410208， China； 3. Yao Sheng-tang （Hunan） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Changsha 415600， China

Abstract： Objective To establish an HPLC method for contents determination of p-coumaric acid and gallic acid in Lilii Bulbus used both as medicine and food. Methods The chromatographic separation was performed on a Hypersil BDC-C18 column （200 mm × 4.6 mm， 5 ?m）； the column temperature was maintained at 25 ℃. For the p-coumaric acid， isocratic elut of methanol - 0.1% formic acid aqueous solution （30：70） was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. For the gallic acid， isocratic elut of methanol - 0.1% phosphoric acid aqueous solution （15：85） was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelengths were at 310 and 270 nm. The injection volume was 10 ?L. Results Under above chromatographic conditions， p-coumaric acid and gallic acid and adjacent other peaks were among the good separation. P-coumaric acid： the regression equation was Y=1×108X+57 335 （r=0.998 7）， and the linear range was 10.00–160.03 ng； gallic acid： the regression equation was Y=3×107X-21 414 （r=0.998 2）， and the linear range was 9.99–159.95 ng. The average recoveries of p-coumaric acid and gallic acid were 95.63% and 96.62% respectively. Conclusion The method is simple， convenient and reliable， which can be used for the quality control of processed Lilii Bulbus decoction and medicated diet.

Keywords： Lilii Bulbus； p-coumaric acid； gallic acid； medicated diet； contents determination

百合為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium broumii F.E.Brown var.viridulum Baker、細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗

基金項(xiàng)目：國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-Y-HUN-24）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃課題（2017-23）

通訊作者：黃惠勇，E-mail：huanghy68@126.com

莖[1-2]，含有多糖、沒食子酸、對(duì)香豆酸及其他皂苷類成分[3-7]，具有養(yǎng)心安神、潤(rùn)肺止咳功效。從食用角度來看，百合含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、淀粉、維生素、鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分。百合為藥食兩用植物，可開發(fā)成百合粥、百合湯等多種藥膳[8-11]。湖南省以種植卷丹百合為主，其中龍山縣卷丹百合種植基地是我國(guó)目前最大的百合種植集中區(qū)，為國(guó)家科技部百合規(guī)范化種植研究基地[12]。對(duì)香豆酸和沒食子酸是百合中重要的活性成分，生物學(xué)效應(yīng)廣泛[13-14]，與百合保健功能密切相關(guān)。在前期研究中，筆者從龍山卷丹百合提取物中分離得到了對(duì)香豆酸和沒食子酸單體。2015年版《中華人民共和藥典》記載的百合藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀鑒別及薄層鑒別，沒有含量測(cè)定項(xiàng)，難以整體控制藥材質(zhì)量，而采用HPLC測(cè)定百合中對(duì)香豆酸和沒食子酸含量的方法目前尚未見報(bào)道。因此，為全面控制百合藥材質(zhì)量，進(jìn)一步研究百合單體藥效基礎(chǔ)，提高分析檢測(cè)效率，本研究建立測(cè)定百合中對(duì)香豆酸、沒食子酸2種主要藥效活性物質(zhì)含量的HPLC方法，為百合的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀、島津LC solution色譜工作站（日本島津公司），METTLER TOLEDO ML204電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-300DE超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)公司）。

沒食子酸、對(duì)香豆酸均為自制（經(jīng)分光光度法、核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜鑒定，HPLC純度不低于98%），符合定量要求。甲醇為色譜純（韓國(guó)SK公司），水為怡寶純凈水，其他試劑為分析純。百合購(gòu)于湖南省龍山縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥系主任周小江教授鑒定為百合科百合屬植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.的干燥鱗莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDC-C18柱（200 nm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：對(duì)香豆酸以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，沒食子酸以甲醇- 0.1%磷酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相等度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫25 ℃；波長(zhǎng)：310 nm（對(duì)香豆酸），270 nm（沒食子酸）；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定對(duì)香豆酸對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解稀釋，配制成每1 mL含對(duì)香豆酸100.02 ?g的對(duì)照品溶液；另精密稱定沒食子酸對(duì)照品適量，置于另一量瓶中，加甲醇溶解稀釋，配制成每1 mL含沒食子酸99.97 ?g的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取百合樣品粉末（過3號(hào)篩）約1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液80 mL，95 ℃水浴回流提取2 h，共提取3次，過濾，合并濾液，減壓干燥蒸干，以甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，對(duì)照品對(duì)香豆酸、對(duì)照品沒食子酸與供試品溶液中2種有效成分達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。對(duì)香豆酸、沒食子酸色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按對(duì)香豆酸峰和沒食子酸峰計(jì)均大于3500。

A

B

C

D

注：A.對(duì)香豆酸對(duì)照品（310 nm）；B.沒食子酸對(duì)照品（270 nm）；

C.供試品（310 nm）；D.供試品（270 nm）；1.對(duì)香豆酸；2.沒食子酸

圖1 卷丹百合中對(duì)香豆酸、沒食子酸HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液1600、800、400、200、100 ?L，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的溶液。另精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液1600、800、400、200、100 ?L，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的溶液。按上述色譜條件，吸取對(duì)香豆酸和沒食子酸各濃度對(duì)照品溶液10 ?L注入色譜儀，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)香豆酸和沒食子酸進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。對(duì)香豆酸線性回歸方程為：Y=1×108X+57 335（r=0.998 7），線性范圍10.00～160.03 ng；沒食子酸線性回歸方程為：Y=3×107X-21414（r=0.998 2），線性范圍9.99～159.95 ng。

2.6 精密度考察

取同一份樣品溶液10 ?L，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，對(duì)香豆酸和沒食子酸峰面積RSD分別為0.70%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法取同一批百合樣品粉末，重復(fù)制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，對(duì)香豆酸和沒食子酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.25%、1.78%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 ?L，在上述色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定分析，記錄色譜峰峰面積，對(duì)香豆酸和沒食子酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.68%、1.82%，表明樣品中2種有效成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的百合樣品粉末6份（每份0.5 g），精密加入15 ?L對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液（相當(dāng)于對(duì)香豆酸1.500 3 ?g），另精密稱取已知含量的同一百合樣品粉末6份（每份0.5 g），精密加入30 ?L沒食子酸對(duì)照品溶液（相當(dāng)于沒食子酸2.999 1 ?g），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，對(duì)香豆酸和沒食子酸加樣回收率分別為95.63%、96.62%，RSD分別為1.18%、1.67%，表明回收率良好。結(jié)果見表1。

2.10 樣品測(cè)定

分別精密稱取9份不同批次的百合樣品粉末（過3號(hào)篩），每份約1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，被測(cè)組分對(duì)香豆酸和沒食子酸與共存組分實(shí)現(xiàn)基線分離，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中對(duì)香豆酸和沒食子酸的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)對(duì)香豆酸、沒食子酸的性質(zhì)，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了條件篩選。對(duì)提取溶劑純甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水等進(jìn)行了提取效果的比較，結(jié)果表明，70%乙醇提取效果最好，故選定70%乙醇作為提取溶劑；提取方式比較了超聲和回流對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示，回流提取效率優(yōu)于超聲提??；提取溫度比較了水浴50、70、90、95 ℃，結(jié)果顯示，水浴95 ℃提取效果最好；提取時(shí)間比較了回流30、60、90、120、150 min對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，回流提取120、150 min的效果相近，均明顯優(yōu)于90、60、30 min的提取效果，綜合能量消耗及提取效率等因素，選定提取時(shí)間為120 min。因此，最終選擇70%乙醇作為提取溶劑，回流提取120 min制備供試品溶液。

本試驗(yàn)采用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)器在190～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，采集光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸和沒食子酸分別在310 nm和270 nm處有最大吸收，故分別選擇310 nm和270 nm作為對(duì)香豆酸和沒食子酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)考察了不同色譜柱Hypersil BDC C18（200 mm×4.6 mm，5 ?m）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）和Servo-PTC18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）的峰形、柱效和分離度，結(jié)果顯示，以Hypersil BDC-C18為最佳；試驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸等不同比例流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度洗脫的效果，結(jié)果表明，對(duì)香豆酸的測(cè)定以甲醇- 0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，沒食子酸的測(cè)定以甲醇-0.1%磷酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相等度洗脫，在此條件下基線平穩(wěn)，供試品各成分峰保留時(shí)間適中，分離度和峰形最佳。故最終優(yōu)選色譜條件為：Hypersil BDC C18柱（200 mm×4.6 mm，5 ?m），對(duì)香豆酸的測(cè)定以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，沒食子酸的測(cè)定以甲醇-0.1%磷酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相等度洗脫，流速1.0 mL/min，對(duì)香豆酸和沒食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)分別為310、270 nm，柱溫25 ℃。在此條件下，基線平穩(wěn)，分離效果好，因此所建立的方法能準(zhǔn)確測(cè)定卷丹百合中對(duì)香豆酸、沒食子酸的含量。

對(duì)卷丹百合樣品的測(cè)定結(jié)果表明，9批樣品中均含有對(duì)香豆酸和沒食子酸，其中沒食子酸比對(duì)香豆酸含量高，但不同批次樣品的2種成分含量有一定差異，可能與藥材種植環(huán)境的氣候、土壤肥力及根系分泌物、產(chǎn)地海拔及工藝流程有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

百合是原衛(wèi)生部審批通過的首批藥食兩用植物，不僅臨床上有著廣泛的應(yīng)用，作為加工保健產(chǎn)品的原料也極具有開發(fā)前景，但2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載的百合藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀鑒別及薄層鑒別，難以全面控制百合藥材的質(zhì)量。且目前百合多以總提取物為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，很少涉及單體成分，進(jìn)一步研究百合中單體成分的藥效十分必要。因此，本研究在對(duì)卷丹百合進(jìn)行系統(tǒng)性的化學(xué)成分分離的基礎(chǔ)上，建立了測(cè)定卷丹百合中對(duì)香豆酸和沒食子酸含量的分析方法。本方法簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確，可為百合飲片、百合復(fù)方成藥及相關(guān)藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-15）

（修回日期：2017-09-24；編輯：陳靜）