植物乳桿菌和干酪乳桿菌的抗氧化活性研究

胡姝敏，劉寶華，孫欣瑤，李曉東，李東花

（1.黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司，哈爾濱150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

0 引言

益生菌為適當(dāng)量服用時(shí)對(duì)宿主健康有益的活體微生物制劑，具有降低血清膽固醇和抗氧化等生理功能。氧化是導(dǎo)致某些疾病的根本原因[1-4]，引起氧化的主要因素則是自由基[5]。如果能夠消除過(guò)多的氧化自由基，相關(guān)疾病便能得到預(yù)防[6]。研究表明，益生菌具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內(nèi)的活性氧分子，使機(jī)體內(nèi)活性氧分子保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[7-9]。

干酪獨(dú)特的理化特性,使其成為了益生菌的良好載體[10]。而 Lucía Abadía-García等人[11]研究表明益生菌能夠提高農(nóng)家干酪的抗氧化性。目前商業(yè)上應(yīng)用的最廣泛的益生菌為乳桿菌屬[12]。所以本論文首先研究植物乳桿菌KLDS1.0202和干酪乳桿菌KLDS1.0319自身的抗氧化性情況，然后確定其在干酪中的抗氧化能力，為功能性食品的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

植物乳桿菌KLDS1.0202；干酪乳桿菌KLDS1.0319，商業(yè)發(fā)酵菌種Lactococcus lactissubsp.C remoris和Lactococcus lactissubsp.lactis混合菌種，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵，DPPH，1,10-鄰二氮菲，硫酸亞鐵，雙氧水。

M RS培養(yǎng)基：酪蛋白消化物10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏10.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.08 g。

M RS固體培養(yǎng)基：在上述M RS液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

JD 500-2電子天平，VD-1320超凈工作臺(tái)，DH 5000A電熱恒溫培養(yǎng)箱，SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋，U LTRA-TURRAX T 8均質(zhì)機(jī)，數(shù)顯恒溫水浴箱，JY-92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，離心機(jī)，GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)，UT-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與保存

植物乳桿菌和干酪乳桿菌作為益生菌采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將MRS培養(yǎng)基于121℃滅菌15 m in，于37℃培養(yǎng)24 h，反復(fù)傳代至菌株的活菌數(shù)在1.0×108m L-1以上，將菌液與50%滅菌甘油按2∶3混合，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物乳桿菌和干酪乳桿菌抗氧化活性的測(cè)定

根據(jù)Lee及宋曉辰等人的方法[13,14]。將篩選得到的乳酸菌株活化，傳代3次后，2%接種于M RS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)轉(zhuǎn)速為4 000 r/m in，4℃離心10m in，收集菌體沉淀，經(jīng)無(wú)菌去離子水洗滌兩次.將上述進(jìn)行一次，收集菌體。將菌體使用生理鹽水調(diào)整OD600=1.0。所得菌懸液分為4組：1組作為活細(xì)胞組；2組，在冰浴條件下使用超聲波粉碎儀進(jìn)行粉碎，300W條件下，每處理5 s，間隔5 s，持續(xù)25m in，顯微鏡下檢查沒(méi)有完整細(xì)胞后，在溫度為4℃轉(zhuǎn)速為8 000 r/m in下，離心15 m in，收集上清液，即為無(wú)細(xì)胞提取物；3組，在溫度為37℃下，培養(yǎng)20 m in，然后在4℃轉(zhuǎn)速為5 000 r/m in，離心15 m in，收集上清液，即為胞外分泌物組；4組，在100℃條件下加熱處理30m in，即為菌體滅活組。

1.3.2.1 菌株清除DPPH自由基能力的測(cè)定

細(xì)胞破碎液離心后取上清液1.0 m L，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH·甲醇溶液1 m L，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30m in，離心后取上清液在517 nm下測(cè)定光密度值，按照下式計(jì)算菌株清除DPPH自由基的能力，以PBS緩沖液作空白對(duì)照。

DPPH自由基清除率=[1-A 517(樣品)/A 517(空白)]×100%。

1.3.2.2 菌株清除羥自由基(·OH)能力的測(cè)定

0.1 m L的EDTA，0.01m L的FeC l3，0.1 m L的H2O2，0.36m L的脫氧核糖，0.33m L的PBS，0.1m L的抗壞血酸混合液中加入1 m L細(xì)胞破碎后的上清液，然后在37℃水浴1 h，水浴完成后向混合液中加入TBA和TCA顯色，形成的粉紅色物質(zhì)在532 nm測(cè)光密度值，按照下式計(jì)算清除羥自由基的能力，以PBS緩沖液作空白對(duì)照。

羥自由基清除率=[1-A532(樣品)/A532(空白)]×100%。

1.3.2.3 菌株還原能力的測(cè)定

反應(yīng)液中菌0.5m L，鐵氰化鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）0.5m L和磷酸鹽緩沖液（PBS濃度為0.2 mol/L，pH＝6.6）0.5 m L混合在50℃水浴20 m in，反應(yīng)后冷卻并加入0.5 m L三氯乙酸（TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）沉淀蛋白。離心后取1 m L上清液與1 m L氯化鐵（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）反應(yīng)，于700 nm下測(cè)吸光度，其中L-半胱氨酸作為標(biāo)品。

1.3.3 益生菌契達(dá)干酪的制作

原料乳→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏殺菌（63℃，30m in）→冷卻（32℃）→添加發(fā)酵劑和益生菌→發(fā)酵（30℃，1 h）→添加CaC l2→添加凝乳酶（0.003%）→凝乳（31℃，1 h）→切割（1 cm3）→攪拌升溫至42℃（每3～5 m in升高1℃）→保溫?cái)嚢瑁?5 m in）→靜置（30 m in）→排乳清→凝塊堆砌（每15 m in反轉(zhuǎn)堆積1次，反轉(zhuǎn)7次）→破碎與加鹽→成型壓榨→包裝、8℃成熟。

1.3.4 益生菌契達(dá)干酪抗氧化活性

共4組契達(dá)干酪，其中空白組（Batch-1）：只添加2%商業(yè)發(fā)酵劑。實(shí)驗(yàn)組：Batch-2為添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%商業(yè)發(fā)酵劑和1.2%植物乳桿菌；Batch-3為添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%商業(yè)發(fā)酵劑和1.2%干酪乳桿菌；Batch-4為添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%商業(yè)發(fā)酵劑、0.6%植物乳桿菌和0.6%干酪乳桿菌。以清除DPPH自由基、還原力和清除羥自由基為指標(biāo)，分別測(cè)定4種契達(dá)干酪的抗氧化活性。

1.3.4.1 組成成分

總蛋白質(zhì)的測(cè)定方法根據(jù)GB5009.5-2010；

脂肪測(cè)定方法根據(jù)GB 5413.3-2010；

水分測(cè)定根據(jù)GB 5009.3-2010中方法；

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB/T 12457-2008中方法。

pH值測(cè)定：干酪與去離子水在無(wú)菌條件下以1∶2的比例均勻混合，用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.3.4.2 水溶性提取物的制備

根據(jù)Kuchroo&Fox[15]的方法制備水溶性提取物（W SE）。30 g干酪加90 m L 50 mm o l/L磷酸鹽緩沖液，并在勻漿器中勻漿10 m in。懸浮液在40℃下利用均質(zhì)機(jī)濾紙過(guò)濾。提取液溫和攪拌1 h（150 r/m in），然后在4℃，3 000 g下離心30 m in。懸浮液通過(guò)W hatm an no.2濾紙過(guò)濾，提取液用1 m o l的HC l調(diào)pH值到4.6，水溶性提取物冷凍干燥并在-18℃下保存使用。

15 m g凍干樣品加1 m L蒸餾水用于還原力分析，50 m g凍干樣品加1 m L蒸餾水用于DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力分析。

1.3.4.3 水溶性提取物抗氧化性的測(cè)定

（1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定。根據(jù)Shim ada等人[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。0.1 m L（質(zhì)量濃度50 m g/m L）水溶性提取物（W SE）樣品與3.9 m L新制備的60 μm ol/L DPPH-甲醇溶液混合，45 m in后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)其吸收值，并用蒸餾水代替樣品作空白。

（2）還原力的測(cè)定。水溶性提取物的還原力根據(jù)Duh等人[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。2.5 m L（質(zhì)量濃度15 m g/m L）樣品加入2.5m L濃度為0.2mol/L（pH＝6.6）磷酸鹽緩沖液，再加入2.5 m L質(zhì)量濃度為10 m g/m L鐵氰化鉀溶液，混合物在50℃下放20 m in，然后加入2.5 m L質(zhì)量濃度為 100 g/L三氯乙酸（TCA），在3 000 g下離心10 m in。2.5 m L上清液加入2.5 m L蒸餾水和0.5m L三氯化鐵（質(zhì)量濃度1mg/m L），在700 nm下測(cè)吸光值。反應(yīng)物吸光值越高，還原能力越強(qiáng)。用和樣品相同濃度的BHT做空白。

（3）羥自由基清除能力的測(cè)定。根據(jù)Liu等人[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。1 m L濃度為0.75mmol/L的1,10-鄰二氮菲，1 m L濃度為0.75mm ol/L的FeSO4，1m L的H2O2（體積分?jǐn)?shù)0.01%）,1.5 m L（0.15 m o l，pH＝7.4）磷酸鹽緩沖液混合，產(chǎn)生羥自由基，再加入1m L樣品溶液，在37℃下培養(yǎng)30 m in。在536nm下測(cè)混合物的吸光值。

式中：A0為代替H2O2和提取物的去離子水的吸光值；A樣為提取液存在時(shí)的吸光值；A空為沒(méi)有提取液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)(M ean)±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件，St Pau l,M N)軟件包中Linear M odels程序進(jìn)行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigm aplot11.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌和干酪乳桿菌抗氧化活性的測(cè)定

將乳酸菌的四種處理成分，包括活細(xì)胞(1組)、無(wú)細(xì)胞提取物（2組）、胞外分泌物（3組）、滅活的菌體（4組），采用DPPH方法、羥自由基清除及還原能力的方法，進(jìn)行抗氧化性的評(píng)價(jià)。

2.1.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

由圖1可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對(duì)DPPH自由基的清除能力比較強(qiáng)。DPPH自由基是一種以氮為中心、比較穩(wěn)定、靈敏的自由基，廣泛地用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性。自由基清除劑可與其單電子配對(duì)，致使其本身深紫色逐漸消失或減弱，其褪色程度與抗氧化物質(zhì)呈現(xiàn)定量關(guān)系。無(wú)論是植物乳桿菌還是干酪乳桿菌，其2組的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH的清除能力最強(qiáng)，分別為53.86%和51.96%。然后是胞外分泌物，其次是菌體滅活組，菌體活細(xì)胞組對(duì)DPPH的清除能力最弱。由圖看出，植物乳桿菌對(duì)DPPH的清除能力均比干酪乳桿菌強(qiáng)。而無(wú)論是無(wú)論是哪一組，植物乳桿菌的DPPH自由基清除能力都高于干酪乳桿菌。

2.1.2 羥自由基清除能力的測(cè)定

圖1 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的DPPH自由基的清除能力

由圖2可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對(duì)羥基的清除能力各有差異。·OH是體內(nèi)氧化性很強(qiáng)的自由基。病理實(shí)驗(yàn)中，常研究·OH的清除作用揭示某些病變?cè)?、衰老機(jī)理。2組的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，分別為13.03%和10.89%。然后是菌體活細(xì)胞組，其次是胞外分泌物，菌體滅活組對(duì)·OH的清除能力最弱。

圖2 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的羥自由基清除能力

2.1.3 還原能力的測(cè)定

由圖3可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對(duì)鐵離子的還原力各有差異。良好的電子供體不僅能使Fe3+還原成Fe2+，從而使吸光值上升；同時(shí)能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm處吸光度越大表明樣品的還原力越強(qiáng)。而良好的電子供體是還原能力強(qiáng)的物質(zhì)。無(wú)論是菌體滅活組、胞外分泌物還是菌體活細(xì)胞組，植物乳桿菌的還原力都大于干酪乳桿菌，但是干酪乳桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力大于植物乳桿菌，并且兩種菌株的無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力在所有分組中最強(qiáng)，分別為0.257和0.305。

圖3 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的還原能力

2.2 益生菌契達(dá)干酪抗氧化活性

2.2.1 益生菌契達(dá)干酪組成成分

干酪產(chǎn)品的成分主要受原料乳的成分和性質(zhì)以及生產(chǎn)過(guò)程的差異這兩方面因素的影響。標(biāo)準(zhǔn)契達(dá)干酪的組成成分如下：蛋白質(zhì)20%～30%，脂肪20%～34%，鹽1%～3%，pH值4.7～5.3。由表1所知，4種契達(dá)干酪樣品組成成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)值均處于文獻(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)契達(dá)干酪的組成成分含量范圍之內(nèi)。并從表中可以看出，4種契達(dá)干酪的組成成分之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明益生菌的添加對(duì)干酪組成成分沒(méi)有顯著的影響，以下抗氧化活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行。

表1 契達(dá)干酪在8℃下成熟24周后組成成分分析結(jié)果 %

2.2.2 水溶性提取物抗氧化性的測(cè)定

2.2.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

由圖4可以看出，4種干酪在24周的成熟過(guò)程中，DPPH自由基的清除能力先增加后減小，并在16周左右達(dá)到最大值，添加益生菌的干酪分別為47.30%，48.65%，51.72%；顯著高于空白組的45.05%(P＜0.05)。這是由于干酪在成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)，生成一些小分子肽，這些肽中有些具有一定的抗氧化性，并且隨著成熟時(shí)間的加長(zhǎng)，還會(huì)形成一些具有抗氧化性的氨基酸，這些物質(zhì)都會(huì)增加契達(dá)干酪的抗氧化性。在16周之后，蛋白質(zhì)降解的速度變得緩慢，生成的具有抗氧化性的肽類物質(zhì)又會(huì)降解成一些不具有抗氧化性的氨基酸，所以在第20周和24周抗氧化性有所降低。乳桿菌已經(jīng)被證明具有產(chǎn)生二肽酶、羧肽酶、三肽酶、氨肽酶和肽鏈內(nèi)切酶的能力[15]，由此可知在四種干酪樣品中，加入植物乳桿菌和干酪乳桿菌的契達(dá)干酪的DPPH自由基清除能力顯著高于空白組(P＜0.05)。

圖4 契達(dá)干酪水溶性提取物的DPPH自由基的清除能力

2.2.2.2 還原力的測(cè)定

由圖5可以看出，四種干酪樣品的還原能力在20周前都會(huì)隨著成熟時(shí)間的增加而增大，尤其在12～20周增長(zhǎng)的較為顯著(P＜0.05)，并在第20周達(dá)到最大值，分別為0.366，0.479，0.515，0.656；而在20周以后有所下降。而加入菌的干酪的還原能力顯著高于空白組干酪樣品的還原性(P＜0.05)，而加入兩種益生菌的干酪的還原力最大。反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm處吸光度越大表明樣品的還原力越強(qiáng)，抗氧化性也就越強(qiáng)，所以結(jié)果表明空白組契達(dá)干酪抗氧化活性較其他三種切達(dá)干酪最低。這是因?yàn)槠踹_(dá)干酪在成熟期間蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解生成小分子物質(zhì)肽、氨基酸等，在成熟前期蛋白質(zhì)降解生成的物質(zhì)的分子量要比后期的分子量大，還原性顯著低于后期生成的氨基酸等小分子量的物質(zhì)，這與K.H.Sabeena Farvin[16]研究的結(jié)果相似。他證明＞30 ku和在10～30 ku之間的大分子片段的還原能力明顯低于抗壞血酸，相反，小于3 ku的低分子物質(zhì)的還原能力要高于抗壞血酸。所以分子量月底的物質(zhì)片段的還原性越強(qiáng)，抗氧化性也就越強(qiáng)。

圖5 契達(dá)干酪水溶性提取物的還原力

2.2.2.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

由圖6可以看出，契達(dá)干酪的羥自由基清除能力隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，尤其在8～16周增長(zhǎng)速度較快，并在第16周左右分別達(dá)到最大值43.86%，46.19%，46.66%和47.43%；在第20和24周有所下降。這是由于加入了益生菌作為抗氧化劑與羥自由基發(fā)生了反應(yīng)，阻止了羥自由基與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生抗氧化肽，使得契達(dá)干酪具有抗氧化性。加入了益生菌的契達(dá)干酪的羥自由基的抑制能力明顯高于未加入益生菌的契達(dá)干酪的羥自由基的抑制能力(P＜0.05)，而加入植物乳桿菌和干酪乳桿菌的羥自由基的抑制能力沒(méi)有明顯的差別(P＞0.05)，加入混合益生菌的契達(dá)干酪要稍高于其他切達(dá)干酪。

圖6 契達(dá)干酪水溶性提取物的羥自由基清除能力

由以上可知，在8℃成熟時(shí)，分別加入植物乳桿菌、干酪乳桿菌和同時(shí)加入兩種益生菌干酪的DPPH自由基清除能力及羥自由基清除能力均在第16周達(dá)到最大值，而還原力在第20周達(dá)到最大值，且均顯著高于空白組(P＜0.05)，表明兩種菌能夠顯著提高干酪的抗氧化活性。

3 結(jié)論

植物乳桿菌KLDS1.0202和干酪乳桿菌KLDS1.0319自身都有一定的抗氧化活性，而且通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于兩種菌株來(lái)說(shuō)，無(wú)細(xì)胞提取物的DPPH自由基和羥自由基的清除能力以及還原能力都是最強(qiáng)的。對(duì)于無(wú)細(xì)胞提取物來(lái)說(shuō)，植物乳桿菌KLDS1.0202的DPPH自由基清除和羥自由基清除能力略高于干酪乳桿菌KLDS1.0319，而干酪乳桿菌KLDS1.0319的還原能力高于植物乳桿菌KLDS1.0202，表明不同的評(píng)價(jià)方法會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和干酪乳桿菌添加到契達(dá)干酪中能夠提高干酪在成熟過(guò)程的抗氧化活性，與空白組契達(dá)干酪相比，分別加入植物乳桿菌KLDS1.0202、干酪乳桿菌KLDS1.0319和同時(shí)加入兩種益生菌干酪的DPPH自由基清除能力、還原力和羥自由基清除能力都有顯著的提高（P＜0.05），DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力在第16周達(dá)到最大值，分別為47.30%，46.19%；48.65%，46.66%和51.72%，47.43%；還原力在第20周達(dá)到最大值，分別為0.479和0.515、0.656。添加益生菌的干酪在組成成分上與空白干酪相比并無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以上表明兩種菌不僅自身具有一定的抗氧化活性，還能促進(jìn)干酪蛋白質(zhì)的分解，提高干酪的抗氧化活性。

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