丙烯腈誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的影響

潘麗，魏倩，高霞，石影，鄭愛，薛紅麗，李芝蘭,*

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州730000 2. 蘭州市婦幼保健院，蘭州730000

丙烯腈(acrylonitrile，ACN)是石化工業(yè)中合成腈綸纖維等高分子材料的重要中間單體[1]，屬于高毒類有機(jī)氰化物。Abo-Salem等[2]用50 mg·kg-1ACN對(duì)雄性Wistar大鼠染毒后，發(fā)現(xiàn)血清AST、ALT、直接膽紅素、總膽紅素升高，肝匯管區(qū)炎癥、組織混亂，肝細(xì)胞毗鄰的匯管區(qū)出現(xiàn)氣球樣變，淋巴細(xì)胞浸潤及脂肪滴，Guang等[3]對(duì)大鼠ACN灌胃染毒后，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟組織MDA含量升高，CAT活性降低，GSH含量降低；金娜[4]對(duì)小鼠的研究也得到相似的結(jié)果，提示ACN可通過擾亂機(jī)體的氧化平衡狀態(tài)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織損傷。彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACN染毒劑量與肝細(xì)胞DNA拖尾率存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示ACN可造成肝細(xì)胞DNA損傷[5]。

氧化應(yīng)激是指因抗氧化機(jī)制受損引發(fā)的自由基和活性氧與蛋白、脂質(zhì)及核酸等體內(nèi)高分子反應(yīng)，致使后者的結(jié)構(gòu)功能出現(xiàn)損害的狀態(tài)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指當(dāng)外界毒物或刺激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致ER內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，ER為了應(yīng)對(duì)其內(nèi)環(huán)境的改變而發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。最近幾年的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)物質(zhì)引起的肝臟損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)[7-8]，而氧化應(yīng)激的產(chǎn)物ROS，可通過氧化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2+離子泵的功能，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，誘發(fā)ERS和細(xì)胞凋亡[9]，故氧化應(yīng)激是ERS的敏感因子。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)及布雷菲爾德菌素 A(blefeldans A，BFA)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)ROS的積累有關(guān)，且芹菜素(apigenin，AP)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)、GSH等抗氧化劑可明顯通過抑制ROS的產(chǎn)生而降低TG及BFA引起的ERS，提示TG及BFA誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞ERS是通過ROS的積累產(chǎn)生氧化應(yīng)激所致，AP可通過抗氧化的作用抑制ERS引起的細(xì)胞凋亡和ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)[10]，認(rèn)為氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)ERS的產(chǎn)生。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，細(xì)胞可依賴相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)制來應(yīng)對(duì)ERS以保證細(xì)胞的正常功能。但當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)過強(qiáng)，機(jī)體無法完成損傷修復(fù)時(shí)，則啟動(dòng)相應(yīng)的凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NAC是L-半胱氨酸的乙?；衔?，可通過干擾自由基的生成和清除已生成自由基來發(fā)揮抗氧化作用，增加機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的能力。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)[11]，而關(guān)于ACN引起的肝損傷是否與ERS有關(guān)，目前尚未見報(bào)道。故本文以ACN對(duì)SD大鼠慢性染毒，同時(shí)設(shè)定N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)組，探討ACN慢性染毒引起大鼠肝臟氧化損傷對(duì)ERS信號(hào)通路的影響，為ACN肝臟毒性機(jī)制深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)成年健康雄性SD大鼠50只，體重250～300 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機(jī)分為5組，每組10只，以12.5、25.0、50.0 mg·kg-1ACN[12]灌胃染毒，NAC組先用300.0 mg·kg-1NAC灌胃30 min后再灌50.0 mg·kg-1ACN[13]，以玉米油(0.5 mL·(100 g)-1)作為陰性對(duì)照組，1次每天、6天每周，共計(jì)13周。大鼠染毒期間實(shí)驗(yàn)室溫度(22±1)℃，濕度50%，晝夜交替各12 h，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑

丙烯腈(分析純，純度>99%)購于天津四通化工廠，NAC購買于美國Amresco公司，GSH、GSH-Px、MDA、SOD、CAT試劑盒購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物有限公司，GRP78一抗(兔抗大鼠)、CHOP一抗(小鼠抗大鼠)、caspase-12一抗(兔抗大鼠)購于美國SAB公司，GAPDH一抗(兔抗大鼠)購于美國Abcam公司，β-tubulin一抗(兔抗大鼠)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HPR標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購于Elabscience公司，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 氧化還原相關(guān)酶的測定

染毒結(jié)束后，處死大鼠。每組隨機(jī)選取6只大鼠，稱取100～200 mg肝臟組織按重量(g)：勻漿介質(zhì)(mL)=1:9的比例充分研磨，低溫離心(4 ℃，2 500 r·min-1，10 min)后分裝上清，按照試劑盒操作說明的步驟完成氧化還原酶指標(biāo)的測定。

1.4 RT-PCR檢測步驟

實(shí)驗(yàn)開始前將所需實(shí)驗(yàn)器材高壓滅菌，采用Trizol法提取肝臟總RNA，0.1% DEPC水溶解 RNA后測定RNA濃度并定量至500 ng·μL-1備用。根據(jù)20 μL RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(Total RNA 10 μL，RNase Free dH2O 6 μL，5×PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time 4 μL)條件，42 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min后70 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，完成肝臟RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟組織GRP78、PERK、CHOP、caspase-12、β-actin mRNA表達(dá)水平(引物序列見表1)，PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)。最后采用Pfaffl法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量[14]。

1.5 Western Blot檢測步驟

提取肝臟組織蛋白進(jìn)行定量與變性制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4 ℃、200 mA轉(zhuǎn)膜75 min后220 mA轉(zhuǎn)膜75 min。在TBST配制的5%脫脂奶粉中封閉3 h，4 ℃水平搖床過夜孵育一抗(GRP78、CHOP、caspase-12、GAPDH、β-tubulin*由于實(shí)驗(yàn)中目的蛋白分子量與內(nèi)參蛋白分子量接近，選擇一個(gè)內(nèi)參蛋白無法區(qū)分，所以實(shí)驗(yàn)選擇GAPDH、β-tubulin 2個(gè)內(nèi)參蛋白。蛋白一抗用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋，稀釋比例分別為1:500、1:1000、1:500、1:2000、1:1000)，TBST漂洗5次，每次5 min，室溫水平搖床孵育二抗2 h后(山羊抗兔單克隆二抗稀釋比例為1:2000，山羊抗小鼠單克隆二抗稀釋比例為1:4000，二抗均用5%TBST稀釋)，取出目的蛋白條帶，TBST漂洗5次，每次5 min。將目的蛋白的PVDF膜放置在凝膠成像曝光儀中滴加ECL發(fā)光液曝光，保存目的蛋白條帶，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算公式為：

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 ACN染毒及NAC干預(yù)對(duì)大鼠肝臟抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示，低、中ACN組大鼠肝臟GSH含量與對(duì)照組比較均降低(P<0.05)；低ACN組大鼠肝臟GSH-Px活力與對(duì)照組比較升高(P<0.05)。低、高ACN組大鼠肝臟SOD活力及MDA含量與對(duì)照組比較均升高(P<0.05)。中、高ACN組大鼠肝臟CAT活力與對(duì)照組比較均降低(P<0.05)。NAC干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)ACN誘導(dǎo)的大鼠肝臟GSH含量、MDA含量及SOD活力的改變。結(jié)果見表2。

2.2 ACN染毒及NAC干預(yù)對(duì)大鼠肝臟ERS相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，高ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較均升高(P<0.05)；低、中ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較均升高(P<0.05)。NAC干預(yù)后，大鼠肝臟CHOP、caspase-12 mRNA表達(dá)水平與高ACN組比較均降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

表2 丙烯腈(ACN)染毒及N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)對(duì)大鼠肝臟抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化的影響Table 2 Effects of acrylonitrile (ACN) on oxidative damage and lipid peroxidation and the intervention in effects of N-acetylcysteine (NAC) in rats liver

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

表3 ACN染毒及NAC干預(yù)對(duì)大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Table 3 Effect of ACN on expression of endoplasmic teticulum stress (ERS) related genes and the intervention in effects of NAC in rats liver

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

2.3 ACN染毒及NAC干預(yù)對(duì)大鼠肝臟ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示，高ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較均升高。NAC干預(yù)后，大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達(dá)水平與高ACN染毒組比較均降低。結(jié)果見表4。

3 討論(Discussion)

圖1 ACN染毒及NAC干預(yù)對(duì)大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響的免疫印記圖Fig. 1 Western Blot analysis on effect of ACN on expression of ERS related proteins and the intervention in effects of NAC in rats liver

分組(Groups)GRP78CHOPcaspase-12對(duì)照組(Control)0.47±0.080.76±0.060.75±0.08高ACN組(50.0 mg·kg-1 ACN)0.93±0.13*1.05±0.10*1.07±0.13*NAC組(300 mg·kg-1 NAC+50 mg·kg-1 ACN)0.60±0.20#0.77±0.12#0.86±0.16#F16.14620.22110.179P0.0000.0000.002

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊及運(yùn)輸場所，也是細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的主要場所[19]。在紫外線、缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、病毒、氧化應(yīng)激、毒性物質(zhì)等各類理化因素存在的情況下可損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能從而誘發(fā)ERS[20]。正常狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein，GRP78)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的雙鏈RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)和肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)3種跨膜蛋白相互結(jié)合而沒有活性，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，大量的未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白將會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集而擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，此時(shí)GRP78將與3種跨膜蛋白發(fā)生解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合堆積的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，起到協(xié)助蛋白折疊的功能，降低ERS，因此GRP78已被廣泛認(rèn)為是ERS發(fā)生的標(biāo)志性分子[21]。同時(shí)，與GRP78解離的3種感受蛋白被暴露激活，通過PERK、ATF6、IRE1這3種途徑啟動(dòng)ERS。ERS作為細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，正常情況下參與機(jī)體應(yīng)對(duì)外在刺激的多重信號(hào)傳導(dǎo)及基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，具有保護(hù)細(xì)胞維持其免受損傷的作用，但當(dāng)ERS過度時(shí)，可通過多種方式導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)錯(cuò)誤[22]，反而激活ERS相關(guān)的凋亡蛋白CHOP及caspase-12等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。CHOP是一種ERS特異性轉(zhuǎn)錄因子[24]，也是ERS介導(dǎo)細(xì)胞由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)化的重要信號(hào)分子[25]。ERS過強(qiáng)時(shí)，可通過 IRE-1、PERK 和 ATF6 的活化促進(jìn) CHOP 的大量表達(dá)，進(jìn)而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞對(duì)ERS的敏感性增加，促進(jìn)凋亡[26]；caspase-12是一類鼠源性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，正常情況下，caspase-12以無活性的酶原形式(procaspase-12)存在，當(dāng)活化之后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-12，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程，其機(jī)制是活化后的caspase-12 進(jìn)一步激活ERS分子caspase-9，活化后的caspase-9 有效切割和活化下游的caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡，因此caspase-12被認(rèn)為是ERS介導(dǎo)凋亡路徑的重要標(biāo)志物[27]。ERS發(fā)生后，GRP78與復(fù)合物分離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊蛋白，從而使caspase-12暴露活化，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[28]。本研究中，ACN染毒后上調(diào)肝臟GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平啟動(dòng)ERS，再通過上調(diào)CHOP、caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)水平啟動(dòng)了ERS相關(guān)凋亡通路，認(rèn)為ACN引起的大鼠肝臟氧化損傷可能是誘導(dǎo)肝臟ERS發(fā)生的原因之一。NAC干預(yù)后，可明顯下調(diào)肝臟GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)水平而阻止ERS的發(fā)生，進(jìn)一步說明ACN引起的大鼠肝臟氧化損傷是引起ERS發(fā)生的原因之一。

致謝：感謝北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院崔富強(qiáng)研究員在文章修改中給予的幫助。

通訊作者簡介：李芝蘭(1962-)，女，碩士研究生導(dǎo)師，教授，蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)研究所所長，研究方向?yàn)閶D女勞動(dòng)衛(wèi)生與生殖健康。

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