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    大氣中細(xì)顆粒物對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲作用的影響

    2018-06-19 02:38:04樊磊劉順包艷英張英杰劉穎屈超張治然襲榮剛王曉波
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:小室劃痕基質(zhì)

    樊磊,劉順,包艷英,張英杰,劉穎,屈超,張治然,襲榮剛,王曉波,*

    1. 中國(guó)人民解放軍第210醫(yī)院藥學(xué)部,大連 116021 2. 大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,大連 116023

    自1985年以來(lái),肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)《中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)[1]數(shù)據(jù)顯示,肺癌也是中國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,在過(guò)去的30年中,肺癌死亡率在中國(guó)上升了465%。國(guó)內(nèi)外環(huán)境流行病學(xué)研究表明,大氣污染程度與城市居民肺癌的發(fā)病率和死亡率關(guān)聯(lián)密切[2]。據(jù)Anenberg等[3]統(tǒng)計(jì)分析,目前全球每年約有14~30萬(wàn)例肺癌患者的死亡與大氣中細(xì)顆粒物暴露有關(guān)。Pope等[4]調(diào)查發(fā)現(xiàn),大氣中細(xì)顆粒物濃度每升高10 μg·mL-1,肺癌病死率增加約8%。雖然流行病學(xué)調(diào)查顯示肺癌發(fā)病率和病死率與大氣中細(xì)顆粒物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性,但其因果聯(lián)系尚待進(jìn)一步的毒理學(xué)、生物學(xué)等機(jī)制研究予以闡明。以PM2.5為代表的大氣細(xì)顆粒物是目前研究的熱點(diǎn),其粒徑小,表面積大,易富集各種重金屬及多環(huán)芳烴等有機(jī)物和病原微生物。這些顆粒物可沉積在細(xì)小支氣管和肺泡[5],并容易通過(guò)肺泡內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),PM2.5可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生心血管毒性[6]、加速皮膚細(xì)胞衰老、導(dǎo)致胚胎畸形[7]。PM2.5的致癌作用主要與其可導(dǎo)致遺傳毒性、激活氧化應(yīng)激通路、免疫損傷以及慢性炎癥反應(yīng)等作用有關(guān)[8-10]。

    由于肺癌發(fā)病隱匿,早期往往沒(méi)有任何癥狀。所以,在臨床中發(fā)現(xiàn)的肺癌患者確診時(shí)約有80%以上已發(fā)展到中晚期,患者五年生存率不足10%[11]。肺癌轉(zhuǎn)移是影響患者生存期限的主要因素,PM2.5是否能促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移目前尚不清楚,因此,在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察了PM2.5對(duì)A549肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的影響,旨在進(jìn)一步闡明PM2.5對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制,為對(duì)其醫(yī)學(xué)防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 主要試劑與儀器

    人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Gibco杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和Gibco胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,抗體MMP-2、抗體MMP-9、抗體E-cadherin、抗體N-cadherin和抗體GAPDH-A均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司,人工基底膜Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司,TGL-20M高速臺(tái)式冰凍離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)湘儀公司,PAC300 型電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司,TS 2000A 型脫色搖床購(gòu)自江蘇海門市分析儀器廠,Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司,BPN-150CRH型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司,PQ200 環(huán)境級(jí)精細(xì)顆粒物采樣器購(gòu)自美國(guó)BGI公司。

    1.2 大氣PM2.5樣品采集

    采集工作由大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心完成,采樣點(diǎn)位于大連市主城區(qū),采樣裝置流量設(shè)定為1.13 m3·min-1。本實(shí)驗(yàn)中使用的PM2.5顆粒為11月采集獲得,采樣時(shí)間為24 h連續(xù)采樣,在空氣重污染期間加密采樣,采樣濾膜密封盒-20 ℃保存。

    1.3 PM2.5 染毒懸液制備

    制備方法參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行,具體方法如下:將采樣濾膜按1 cm×1 cm剪裁,放入0 ℃預(yù)冷去離子水中超聲振蕩3次,每次20 min,收集洗脫液后用多層脫脂紗布過(guò)濾,再用 5 μm 微孔濾膜過(guò)濾,濾液4 ℃、 12 000 r·min-1離心 30 min,收集下層懸液冷凍過(guò)夜,真空冷凍干燥成干粉,稱量PM2.5干粉后用環(huán)氧乙烷滅菌,再加入無(wú)菌生理鹽水配制成 1 000 mg· mL-1的母液, -80 ℃避光保存?zhèn)溆谩?染毒前超聲振蕩使顆粒物充分混勻,用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需工作液。

    1.4 MTT 比色法檢測(cè)PM2.5對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

    將細(xì)胞消化、重懸并吹打成單個(gè)細(xì)胞后計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整成1×104個(gè)·mL-1,按每孔200 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后給藥。實(shí)驗(yàn)分組為:空白對(duì)照組,溶劑對(duì)照組,不同濃度給藥組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。給藥24 h后,每孔加入20 μL噻唑藍(lán)溶液(MTT)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸盡各孔培養(yǎng)液,每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度值(OD值),計(jì)算各組吸光度的平均值,按照下列公式計(jì)算細(xì)胞生存率:生存率%=(OD給藥組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

    1.5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上黏附的測(cè)定

    用10 mg·L-1纖連蛋白(Fibronectin),50 mg·L-1人工基底膜(Matrigel) 1:8稀釋液和10 g·L-1牛血清蛋白(BSA)作為基底膜包被96 孔板,BSA為對(duì)照基底,4 ℃過(guò)夜。加入含1% BSA的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液 (50 μL·孔-1) 37 ℃孵育30 min水化基底膜。胰酶消化PM2.5處理24 h的A549細(xì)胞,計(jì)數(shù)并以1×105個(gè)·孔-1接種于96孔板中,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)1 h后,移去細(xì)胞懸浮液,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕洗3次,除去未貼壁細(xì)胞。按照MTT比色法測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處光吸收值(OD值),以BSA對(duì)照基底膜OD值為參考,按公式分別計(jì)算細(xì)胞在Matrigel和Fibronectin上的黏附率:黏附率(%)=[(各組細(xì)胞OD值/BSA組細(xì)胞OD值)-1]×100% 。

    1.6 Western blot 法測(cè)定PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    接種A549細(xì)胞于6 孔板中,每孔 2×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后給予PM2.5,繼續(xù)孵育24 h。提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,采用 BCA法測(cè)定蛋白濃度。向細(xì)胞裂解液中加入適當(dāng)體積的5×蛋白上樣緩沖液,混勻后置于沸水中5 min。根據(jù)蛋白濃度,按照 20 μg/樣品的總蛋白量計(jì)算電泳上樣量。選用6%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行蛋白電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。依據(jù)蛋白分子量的指示,按照目標(biāo)蛋白的分子量剪裁PVDF膜后放入用PBST配制的5%脫脂奶粉溶液中,室溫封閉 2 h。加入一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜,加入相應(yīng)二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用化學(xué)法發(fā)光,使用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Image J軟件分析發(fā)光得到蛋白條帶,記錄灰度值用于統(tǒng)計(jì)分析。

    1.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

    用記號(hào)筆在6孔板背后畫3條間隔均勻的直線作為定位線。將A549細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)接種于6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞均勻鋪滿培養(yǎng)孔底部后用100 μL的移液槍頭在細(xì)胞上劃痕,垂直于定位線。將劃痕與定位線的交點(diǎn)作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)。用PBS洗凈漂浮細(xì)胞后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基,在倒置顯微鏡下拍照記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)的劃痕寬度,作為0 h時(shí)間點(diǎn)記錄。給予相應(yīng)濃度的PM2.5,將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)的劃痕寬度。用Image J軟件計(jì)算劃痕寬度,按照公式計(jì)算劃痕愈合率:劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)方法具體如下[13]:將人工基底膜Matrigel按照1:8的比例與預(yù)冷DMEM混勻后按照每孔50 μL加入Transwell小室,使其均勻鋪滿小室底膜。將Transwell小室置于24孔板中,放入4 ℃冰箱過(guò)夜。于接種細(xì)胞前2 h將培養(yǎng)板從冰箱中取出,放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。將A549細(xì)胞按照每孔5×104接種于Transwell小室中。小室下部的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含10 ng·mL-1的EGF,含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL。細(xì)胞接種6 h后給予相應(yīng)濃度的PM2.5,設(shè)置一個(gè)對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔,設(shè)置一組不加細(xì)胞的小室為空白對(duì)照孔。給PM2.5后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,取出Transwell小室,用4%多聚甲醛溶液固定15 min,待風(fēng)干后置于0.1%的結(jié)晶紫乙醇溶液中染色15 min。染色后用PBS漂洗Transwell小室,并用棉簽將小室底膜上部未穿膜細(xì)胞擦去,小室下部即為侵襲細(xì)胞。在顯微鏡下觀察后拍照,再將小室底膜浸入300 μL、33%的乙酸溶液中,使細(xì)胞中的結(jié)晶紫全部溶解于乙酸中。將溶解了結(jié)晶紫的乙酸溶液移入96孔板中,用酶標(biāo)儀檢測(cè)乙酸溶液在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值(OD),將空白對(duì)照孔的吸光值作為背景在計(jì)算各組OD值時(shí)減去。

    1.9 明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性

    給予A549細(xì)胞PM2.5后在無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)液上清,將上清液移入離心管中 2 000 r·min-1離心10 min, 測(cè)定上清蛋白濃度后與5×上樣緩沖液混合,配制含1%明膠的分離膠和不含明膠的濃縮膠,根據(jù)蛋白濃度確定上樣量,低溫電泳100 V 1.5 h;電泳結(jié)束后將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100,50 mmol·L-1Tris -HCl,5 mmol·L-1CaCl2,pH=7.6)中振蕩洗脫后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脫液) 漂洗,接著將凝膠置于孵育液(50 mmol·L-1Tris - HCl, 10 mmol·L-1CaCl2, 0.02% Brij-35, pH7.6) 中37 ℃孵育42 h;孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% 考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3 h,以及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%,乙酸濃度分別為10%、10%、5%) 分別脫色0.5、1、2 h后,顯示出MMP-2(72 KD) 和MMP -9(92 KD)為位于藍(lán)色背景上的透亮帶,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積、寬度和灰度值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 不同濃度 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

    給予A549細(xì)胞不同濃度的PM2.5作用24 h后,MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率可以得出,細(xì)胞的存活率隨PM2.5濃度的增加而減少(見(jiàn)圖1),當(dāng)PM2.5濃度大于等于12 μg· mL-1時(shí),細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),利用軟件計(jì)算PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的IC50為11 μg·mL-1。

    2.2 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上黏附性的影響

    PM2.5預(yù)處理細(xì)胞后,A549細(xì)胞與Matrigel和Fibronectin這2種基質(zhì)的黏附能力較正常對(duì)照組均有所增強(qiáng)(P<0.01),結(jié)果如表1所示。

    2.3 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移作用的影響

    細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的實(shí)驗(yàn)之一。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中,細(xì)胞異常增強(qiáng)的遷移能力是腫瘤細(xì)胞穿越組織屏障的細(xì)胞生物基礎(chǔ)[14]。由于高濃度的PM2.5可明顯降低細(xì)胞存活率,因此為了排除PM2.5的細(xì)胞毒作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,我們根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)測(cè)得的IC50值,選用10 μg·mL-1和 20 μg·mL-1為給藥濃度,并在以下實(shí)驗(yàn)中,均用該濃度給藥。為了避免細(xì)胞增殖對(duì)結(jié)果的影響,本實(shí)驗(yàn)選擇含低濃度(1%)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,并且選擇的時(shí)間點(diǎn)在細(xì)胞增殖周期以內(nèi)(24 h)。用不同濃度的PM2.5處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5可刺激A549細(xì)胞的遷移速率。如圖2所示,不同濃度的PM2.5明顯增加了細(xì)胞劃痕的愈合率,與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。

    圖1 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effects of PM2.5 on the survival rate of A549 cells

    組別Group與Matrigel的粘附率/%Adhesion rates with Matrigel/%與Fibronectin的粘附率/%Adhesion rates with Fibronectin/%正常對(duì)照組Control group24.6±3.323.1±2.5溶劑對(duì)照組Vehicle control group23.2±2.624.5±3.4低濃度PM2.5暴露組Low concentration PM2.5 exposure group37.1±3.5*35.2±2.2*高濃度PM2.5暴露組High concentration PM2.5 exposure group59.3±3.1*56.1±3.3*

    注:*P<0.05與正常對(duì)照組對(duì)比。

    Note:*P<0.05 compared with control group.

    圖2 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移的影響注:A. 利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的PM2.5處理A549細(xì)胞24 h后,劃痕的愈合情況照片;B. 測(cè)量劃痕寬度,按照公式計(jì)算劃痕愈合率:劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。Fig. 2 Effects of PM2.5 on cell migration of A549 cellsNote:(A) Migration of cancer cell line A549 was assessed by wound-healing assay. A scratch wound was created on the cell surface and then PM2.5 were added. The cultures were photographed at 0 h and 24 h. (B) The cell wound closure rate was measured at 24 h and was calculated according to the equation: Wound closure% = [1 -(wound area at Tt / wound area at T0)] × 100%.

    圖3 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響注:A. 用不同濃度的PM2.5處理A549細(xì)胞24 h后,進(jìn)入小室下膜的細(xì)胞結(jié)晶紫染色照片(100×);a. 正常對(duì)照組,b. 溶劑對(duì)照組,c. 低濃度PM2.5暴露組,d. 高濃度PM2.5暴露組。B. 乙酸溶解小室下膜細(xì)胞中結(jié)晶紫后在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。*P<0.05與正常對(duì)照組對(duì)比。Fig. 3 Effect of PM2.5 on invasion of A549 cellsNote: A. Cells were treated with various concentrations of PM2.5 for 24 h, and cell invasion assay was performed. The invaded cells were photographed (100× magnification), a. control group, b. vehicle control group, c. low concentration PM2.5 exposure group, d. high concentration PM2.5 exposure group. *P<0.05 compared with control group.

    2.4 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

    在腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)中,腫瘤細(xì)胞被小室下部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所驅(qū)動(dòng),通過(guò)分泌基質(zhì)酶降解鋪在小室內(nèi)膜表面的基質(zhì)膠,從膜微孔中穿透后抵達(dá)小室下方。抵達(dá)小室下方的細(xì)胞數(shù)量反映了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM2.5可增加A549細(xì)胞進(jìn)入小室下膜的細(xì)胞數(shù)量,提示其侵襲能力在PM2.5的作用下得到增強(qiáng)。如圖3所示。

    2.5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶活性的影響

    上述研究表明,PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力具有明顯的促進(jìn)效應(yīng),而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是影響細(xì)胞侵襲能力的重要酶類,具有侵襲能力的腫瘤細(xì)胞均可分泌MMPs。為研究PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響是否與MMPs的活性有關(guān),我們利用明膠酶譜試驗(yàn)檢測(cè)了MMPs的2個(gè)亞型MMP-2和MMP-9的活性。腫瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性與其侵襲能力密切相關(guān),明膠是這2種酶的作用底物,通過(guò)酶譜法檢測(cè)樣本中MMP-2和MMP-9對(duì)明膠的分解效應(yīng),可判斷其酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予A549細(xì)胞PM2.5處理24 h后,2個(gè)濃度組中細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9活性均明顯增加,結(jié)果如圖3所示。

    2.6 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    通過(guò)Westem blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。其中與細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯增加,而細(xì)胞黏附蛋白E-cadherin表達(dá)量下降,N-cadherin的表達(dá)量升高,如圖4所示。

    3 討論(Discussion)

    國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示PM2.5暴露水平與肺癌的發(fā)病率及病死率呈正相關(guān)[15-17],PM2.5導(dǎo)致肺癌發(fā)生和發(fā)展的病理生理機(jī)制也得到了實(shí)驗(yàn)性研究結(jié)論的初步闡明。PM2.5的化學(xué)組分中,重金屬、多環(huán)芳香烴等成分已被證實(shí)與肺癌的發(fā)生有確切的因果關(guān)系,這些物質(zhì)可通過(guò)損傷免疫系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、抑制DNA修復(fù)和增加DNA突變率等多種途徑誘發(fā)肺癌。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者預(yù)后的重要因素,關(guān)于PM2.5促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道較少,吳鴻章等[12]研究發(fā)現(xiàn),PM2.5暴露能通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、MMP-9與低氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)基因的表達(dá),促進(jìn)肺癌移植瘤新生血管形成。腫瘤轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程,細(xì)胞的遷移、黏附和侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵步驟,我們通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究了大氣來(lái)源的PM2.5對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵步驟的影響。由于較高濃度的PM2.5可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的活性,因此我們根據(jù)MTT比色實(shí)驗(yàn)獲得的IC50選用較低的給藥濃度以排除PM2.5對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種體外檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的實(shí)驗(yàn),腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力與其轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[18],我們發(fā)現(xiàn)PM2.5可明顯增加A549細(xì)胞劃痕的愈合速率,說(shuō)明細(xì)胞的遷移能力受到了影響,腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力可能增強(qiáng)。高侵襲的腫瘤細(xì)胞與基底膜成分的異質(zhì)性黏附能力通常增高,而腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力則會(huì)下降。這有利于腫瘤細(xì)胞與腫瘤母體分離,并侵犯基底膜等正常組織。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PM2.5能增加A549細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel和Fibronectin的黏附率,細(xì)胞間黏附蛋白E-cadherin表達(dá)下降,而細(xì)胞-基質(zhì)黏附蛋白N-cadherin表達(dá)升高初步揭示了PM2.5影響A549細(xì)胞-基質(zhì)黏附作用的機(jī)制。E-cadherin表達(dá)下降,N-cadherin表達(dá)升高也是腫瘤細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要表型,腫瘤細(xì)胞可通過(guò)EMT獲得遷移和侵襲能力[19]。研究發(fā)現(xiàn),香煙提取物可通過(guò)激活Rac1/Smad2和Rac1/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生,進(jìn)而導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)[20],本實(shí)驗(yàn)表明:大氣來(lái)源的PM2.5同樣具備該效應(yīng)。

    圖4 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2活性的影響Fig. 4 Effect of PM2.5 on activities of MMP-2 and MMP-9 in A549 cells

    圖5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of PM2.5 on the expression of metastasis associated proteins in A549 cells

    隨后,我們研究了PM2.5對(duì)A549細(xì)胞穿透基質(zhì)膠能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5處理后,可穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯增加,說(shuō)明PM2.5可明顯增加細(xì)胞的侵襲能力。由于A549細(xì)胞的侵襲能力與其分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)相關(guān),我們利用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PM2.5對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中MMPs的活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活力在PM2.5作用后均明顯增強(qiáng)。Western blot 結(jié)果顯示細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)量也明顯升高,說(shuō)明這2種基質(zhì)金屬蛋白酶活力增強(qiáng)可能與其蛋白表達(dá)量升高有關(guān)。

    綜上所述,高濃度的PM2.5具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用,而較低濃度的PM2.5可促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)黏附、增加細(xì)胞遷移速率和侵襲能力。該結(jié)果提示PM2.5可能通過(guò)增強(qiáng)上述細(xì)胞生物學(xué)作用促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移,但本實(shí)驗(yàn)僅是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)且PM2.5樣本來(lái)源有限,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定局限性,該效應(yīng)及其機(jī)制還有待進(jìn)一步體內(nèi)研究證實(shí)和深入。

    通訊作者簡(jiǎn)介:王曉波(1961-),男,藥學(xué)博士,主任藥師,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)樾滤幯邪l(fā)、藥物分析,發(fā)表學(xué)術(shù)論文200余篇。

    參考文獻(xiàn)(References):

    [1] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(2): 115-132

    [2] 張曉, 楊瓊英, 林國(guó)楨, 等. 大氣污染與居民肺癌發(fā)病及死亡灰色關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2014, 30(2): 165-171

    Zhang X, Yang Q Y, Lin G Z, et al. Grey relational analysis on association between urban air pollution and lung cancer in China [J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(2): 165-171 (in Chinese)

    [3] Anenberg S C, Horowitz L W, Tong D Q, et al. An estimate of the global burden of anthropogenic ozone and fine particulate matter on premature human mortality using atmospheric modeling [J]. Environmental Health Perspectives, 2010, 118(9): 1189-1195

    [4] Pope C A, Burnett R T, Thun M J, et al. Lung cancer, cardiopulmonary mortality, and long-term exposure to fine particulate air pollution [J]. The Journal of the American Medical Association, 2002, 287(9): 1132-1141

    [5] 董雪玲. 大氣可吸入顆粒物對(duì)環(huán)境和人體健康的危害 [J]. 資源產(chǎn)業(yè), 2004, 6(5): 50-53

    Dong X L. Impact of inhalable particles in atmosphere on environment and human health [J]. Resources and Industries, 2004, 6(5): 50-53 (in Chinese)

    [6] Ying Z, Xie X, Bai Y, et al. Exposure to concentrated ambient particulate matter induces reversible increase of heart weight in spontaneously hypertensive rats [J]. Particle and Fibre Toxicology, 2015, 12: 15

    [7] Kim J Y, Lee E Y, Choi I, et al. Effects of the particulate matter 2.5 (PM2.5) on lipoprotein metabolism, uptake and degradation, and embryo toxicity [J]. Molecules and Cells, 2015, 38(12): 1096-1104

    [8] 樓煜清, 韓寶惠. PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響[J]. 臨床內(nèi)科雜志, 2015, 32(4): 234-237

    Lou Y Q, Han B H. The effects of PM2.5on the occurrence of tumor development in respiratory system [J]. Journal of Clinical Internal Medicine, 2015, 32(4): 234-237 (in Chinese)

    [9] Dai L, Mehta A, Mordukhovich I, et al. Differential DNA methylation and PM2.5species in a 450K epigenome-wide association study [J]. Epigenetics, 2017, 12(2): 139-148

    [10] Chu J H, Hart J E, Chhabra D, et al. Gene expression network analyses in response to air pollution exposures in the trucking industry [J]. Environmental Health: A Global Access Science Source, 2016, 15(1): 101-111

    [11] Frazier J L, Garonzik I M, Rhines L D. Metastatic Lung Cancer [M]. Blackwell Publishing, Inc., 2008: 199-220

    [12] 吳鴻章, 方來(lái), 麻慶樂(lè), 等. 大氣細(xì)顆粒物 PM2.5對(duì)肺癌血管新生的影響[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 40(10): 723-734

    Wu H Z, Fang L, Ma Q L, et al. Effect of PM2.5induced angiogenesis in lung cancer [J]. Journal of Zhejiang Chinese Medical University, 2016, 40(10): 723-734 (in Chinese)

    [13] Fan L, Li Y, Sun Y, et al. Paris Saponin VII inhibits the migration and invasion in human A549 lung cancer cells [J]. Phytotherapy Research, 2015, 29(9): 1366-1372

    [14] Friedl P, Wolf K. Tumour-cell invasion and migration: Diversity and escape mechanisms [J]. Nature Reviews Cancer, 2003, 3(5): 362-374

    [15] Yang B, Chen D, Zhao H, et al. The effects for PM2.5exposure on non-small-cell lung cancer induced motility and proliferation [J]. Springer Plus, 2016, 5(1): 2059-2068

    [16] Chen L, Shi M, Gao S, et al. Assessment of population exposure to PM2.5for mortality in China and its public health benefit based on BenMAP [J]. Environmental Pollution, 2017, 221: 311-317

    [17] Badyda A J, Grellier J, Dadrowiecki P. Ambient PM2.5exposure and mortality due to lung cancer and cardiopulmonary diseases in Polish cities [J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2017, 944: 9-17

    [18] Wells A, Grahovac J, Wheeler S, et al. Targeting tumor cell motility as a strategy against invasion and metastasis [J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2013, 34(5): 283-289

    [19] Seyfried T N, Huysentruyt L C. On the origin of cancer metastasis [J]. Critical Reviews in Oncogenesis, 2013, 18(1-2): 43-73

    [20] Shen H J, Sun Y H, Zhang S J, et al. Cigarette smoke-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition is mediated by Rac1 activation [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1840(6): 1838-1849

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