凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病(AHPND)病原分離鑒定及其致病性分析*

賈 丹 史成銀 黃 倢 張慶利 萬曉媛許 華 劉冉陽 王海波 郭程程 謝國駟①

(1. 農業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)作為優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，20世紀80年代引入我國，現已成為我國主要的養(yǎng)殖蝦類，在我國漁業(yè)經濟中占有重要地位。2015年該品種養(yǎng)殖產量達162.5萬t，占我國對蝦總產量的 80%以上(農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局, 2016)。但同其他經濟水生養(yǎng)殖動物一樣，各類疫病頻發(fā)的現狀已嚴重威脅到包括凡納濱對蝦在內的對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(Flegel, 2012; Thitamadee et al, 2016)。

2010年以來，早期死亡綜合癥(Early mortality syndrome, EMS)/急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)在全球蝦類主要養(yǎng)殖地區(qū)肆虐，給越南、中國、馬來西亞、泰國、墨西哥和菲律賓等國對蝦產業(yè)帶來巨大損失(Tran et al, 2013; Joshi et al, 2014; Nunan et al, 2014; Dabu et al, 2017; de la Pe?a et al, 2015; Kongrueng et al, 2015; Soto-Rodriguez et al, 2015)。該疫病因在早期(投苗30 d左右)引起蝦苗不尋常的高死亡率而被稱之為 EMS。2012年8月，亞太水產養(yǎng)殖中心網絡(NACA，2012)針對感染該疫病的對蝦肝胰腺盲管從中段到末端進行性變性，B、F和R細胞功能紊亂，部分細胞核膨大，肝胰腺盲管上皮細胞壞死或脫落，在后期肝胰腺盲管間或盲管內血細胞浸潤，肝胰腺被細菌二次感染等組織病理學特征，正式命名該疫病為AHPND，以區(qū)別也可引起對蝦早期死亡的其他疾病，但在該會上并未確定該疫病的致病原因。世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health, OIE)當前給出的AHPND定義也是參照上述的研究結果。目前認為對蝦AHPND是由部分致病性弧菌所引起的，這些弧菌均攜帶著編碼毒力蛋白 PirVP的質粒。已報道的可引起對蝦AHPND的弧菌種類包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、歐文斯氏弧菌(Vibrio owensii)和坎貝氏弧菌(Vibrio campbellii)(Lee et al, 2015; Kondo et al, 2015; Liu et al, 2015;Dong et al, 2017)。

2016年 3月山東省濰坊市某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場下塘38 d的蝦苗(2～4 cm)出現大規(guī)模急性死亡，發(fā)病蝦表現為空腸空胃，肝胰腺顏色變淺或發(fā)白，伴有肌肉輕微渾濁等癥狀，與AHPND臨床特征相似(Tran et al,2013)。以肝胰腺DNA為模板的病原檢測中，AHPND致病相關的 pirAVP和 pirBVP基因的檢測結果也呈陽性。以此為基礎，本研究進行疑似AHPND感染對蝦的細菌病原的分離鑒定及致病性分析，以期掌握該病原的基本生物學特征，為蝦類AHPND病原的流行病學及其藥物防控研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦

患病凡納濱對蝦于2016年3月采自山東省濰坊市某養(yǎng)殖場，體長約為2～4 cm。健康凡納濱對蝦購自山東省濰坊市另一養(yǎng)殖場，平均體長為(3.1±0.2) cm。健康對蝦采用室內水箱(60 cm×30 cm×40 cm)養(yǎng)殖，實驗期間，水溫為(28±1)℃，正常投餌管理，24 h充氣，每天吸污、換水1/2。實驗前暫養(yǎng)1周。

1.2 細菌分離

用無菌接種環(huán)蘸取患病蝦肝胰腺樣品，劃線接種于添加了2% NaCl的TSA+固體平板(北京陸橋技術股份有限公司)上，28℃恒溫培養(yǎng)，并對形態(tài)一致的優(yōu)勢菌進行純化，菌株編號為20160303005-1。

1.3 菌株的API-20NE鑒定

按照 API-20NE鑒定試劑盒(梅里埃公司)說明書對菌株20160303005-1進行鑒定。

1.4 菌株的血清型鑒定

按照血清檢測試劑盒(天津生物芯片技術有限責任公司)說明書，對純化的菌株20160303005-1進行O和K抗原血清型鑒定，該試劑盒含有O抗原(13種單價，1種多價)和K抗原(65種單價，9種多價)。

1.5 菌株特定基因的PCR擴增及測序

以煮沸菌液的上清為模板，按 Premix Ex Taq Version2.0(TaKaRa，大連)說明書，進行菌株各基因的PCR擴增，包括16S rRNA、分子伴侶蛋白groEL基因、與AHPND致病相關的pirAVP和pirBVP基因、耐熱直接溶血毒素基因tdh和相對耐熱直接溶血毒素基因trh。所用引物見表1。25 μl的PCR反應體系包含 Premix Ex Taq 12.5 μl，正、反向引物(10 μm/L)各0.5 μl，模板 DNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl。擴增條件為94℃預變性7 min；94℃變性40 s，適當溫度退火30 s，72℃延伸一定時間，30個循環(huán)；72℃溫育 10 min。其中，16S rRNA基因退火溫度為 54℃，72℃延伸90 s；groEL退火溫度為 58℃，72℃延伸 1 min；pirAVP和pirBVP基因退火溫度為60℃，72℃延伸30 s。PCR產物用 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒(OMEGA，美國)純化，再用 pEASY-T5克隆載體試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行連接轉化。陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。采用NCBI中的BLAST工具進行核酸序列的比對分析，MEGA7軟件用于基于鄰接法(Neighbor-Joining,NJ法)的 groEL基因的系統(tǒng)進化樹的構建，并進行1000次的Bootstraps重復檢驗。

1.6 對蝦急性感染實驗及組織病理分析

健康凡納濱對蝦隨機分成 3個組(感染組、對照組和空白組)，15尾/組，每組設3個平行。急性感染參照Tran等(2013)的方法。

表1 本實驗所用的引物Tab.1 Primers used in this study

感染組：將400 ml濃度為2.01×109CFU/ml的菌液(含2% NaCl的TSB+液體培養(yǎng)基)加入到3.6 L海水中，充氣；將實驗對蝦放入其中浸浴15 min后，再移入40 L添加了40 ml濃度為2.01×109CFU/ml菌液的海水中，充氣觀察。

對照組：參照感染組，但養(yǎng)殖海水中僅添加無菌TSB+；空白組：對蝦放入40 L海水中養(yǎng)殖。

取感染組的瀕死蝦及對照組和空白組蝦的肝胰腺、胃、腸及鰓組織，置于Davidson’s AFA固定液中，固定24 h后更換為75%乙醇保存。按常規(guī)病理組織學方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察。

美國ASCO公司是世界500強之一的美國艾默生集團成員，隸屬于Emerson自動化解決方案平臺。ASCO融合流體控制與流體動力的先進技術，為廣泛的過程和制造行業(yè)及各種應用需求提供流體自動化產品和全面解決方案。作為世界領先的高品質電磁閥和流體自動化產品的設計者及制造商，ASCO可為所有重要的工業(yè)領域提供超過50 000種的全系列電磁閥以及多種氣源處理、控制元件、執(zhí)行機構、過濾器、調節(jié)器及全套附件。

1.7 菌株的致病力分析

健康凡納濱對蝦隨機分成 7個組(6個感染組和1個對照組)，12尾/組，每組設3個平行。

感染組：將1.64×109CFU/ml濃度的菌液離心并重懸于海水中，再 10倍梯度稀釋為 1.64×102～1.64×107CFU/ml的6個梯度。

對照組：對蝦放入不含有菌液的海水中養(yǎng)殖。實驗期間，對蝦正常飼養(yǎng)管理，每天換水量為總水體的1/2，并相應補充菌液以維持海水中原菌液濃度。連續(xù)觀察7 d，記錄對蝦死亡情況。根據不同細菌濃度浸泡下的實驗蝦的累積死亡數進行細菌致病力評估，采用Reed等(1938)方法計算LD50。

實驗期間，隨機取18尾瀕死蝦的肝胰腺，接種于TSA+平板，用其分離菌株為模板，進行pirAVP和pirBVP基因的PCR檢測分析。

1.8 菌株的藥敏性分析

按照 ATB G-5腸細菌藥敏試劑盒(梅里埃公司)說明書，進行菌株的藥物敏感性分析，該試劑盒含有阿莫西林等21種藥物。

2 結果

2.1 菌株20160303005-1的API-20NE鑒定及理化特征

API-20NE鑒定系統(tǒng)對菌株的理化指標檢測結果如表2所示，該鑒定結果顯示，菌株20160303005-1為副溶血弧菌，其鑒定百分率值為99.1%。

2.2 細菌16S rRNA和groEL基因序列分析

基于 16S rRNA基因序列分析結果顯示，20160303005-1株屬于弧菌屬，與副溶血弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等弧菌的相似度超過99%，但其菌種無法確定。進一步對groEL基因進行序列分析，所構建系統(tǒng)進化樹顯示，該菌株與副溶血弧菌聚為一支(圖 1)。上述結果再結合菌株的理化特征，將該分離菌株鑒定為副溶血弧菌。

2.3 菌株的血清型鑒定結果

血清試劑盒檢測結果顯示，菌株20160303005-1的O抗原為O1型，但其K抗原不屬于檢測試劑盒的65種K抗原中的任何一種，即為不可分型(Untypeable)類，也即該菌株血清型為O1:KUT(K untypeable)。

2.4 致病基因的PCR擴增

表2 菌株20160303005-1的理化特征Tab.2 Phenotypic characteristics of isolated 20160303005-1

2.5 對蝦急性感染及其病理分析

急性感染的凡納濱對蝦，感染后3 h沒有明顯癥狀，但個別對蝦開始死亡；6 h對蝦出現空腸空胃，肝胰腺顏色變淺，死亡蝦增多；9 h對蝦肝胰腺呈淺白色并萎縮變小(圖3A)，死亡數過半；12 h對蝦整個身體幾近透明，部分對蝦甲殼變軟；甲殼變軟癥狀在18 h更為明顯，24 h對蝦死亡率達到100%。而對照組對蝦(圖3B)攝食正常，活力良好，無死亡。

圖3 感染20160303005-1組與對照組凡納濱對蝦Fig.3 The shrimp infected by the isolated strain 20160303005-1 and normal L. vannameiA：感染組蝦(感染9 h)；B：對照組蝦A: 20160303005-1 infected shrimp (9 h post-challenged);B: Normal shrimp in the control group

對感染后 12 h的瀕死蝦進行組織病理切片觀察，與對照組(圖 4A)相比，感染組凡納濱對蝦的肝胰腺小管上皮細胞嚴重萎縮，大量壞死、脫落，導致肝胰腺小管變薄、崩塌(圖4B)，呈典型的AHPND病理特征。

2.6 菌株20160303005-1的致病力分析

用菌株20160303005-1浸泡感染凡納濱對蝦，各組的7天累積死亡情況如圖5所示，經計算，其LD50值為7.96×103CFU/ml。以隨機所取18尾瀕死蝦肝胰腺中分離的細菌為模板，pirAVP和pirBVP基因的PCR擴增結果均為陽性，該結果提示對蝦死于該病原感染。實驗期間，對照組對蝦正常無死亡。

圖4 凡納濱對蝦的肝胰腺HE染色組織切片觀察Fig.4 HE-stained histological sections of the hepatopancreas of L. vannameiA：對照組；B：AHPND特征感染組(浸泡12 h后)，箭頭表示脫落的肝胰腺小管上皮細胞A: Normal shrimp from the control group; B: Infected shrimp with the lesions characteristic of AHPND from the immersion treatments at 12 h post-challenged. Necrotic sloughing of hepatopancreas (HP) tubule epithelial cells (arrows) are shown in the HP tubule lumens

圖5 實驗各組的累積死亡率(平均值±標準差)Fig.5 The cumulative mortality of L. vannamei in different treatments (Mean±SD)

2.7 菌株20160303005-1的藥物敏感性

菌株20160303005-1的藥敏結果見表3。從表3可以看出，菌株20160303005-1對慶大霉素、環(huán)丙沙星等16種藥物敏感，但對阿莫西林、替卡西林、頭孢噻吩、頭孢呋辛、復方新諾明這 5種藥物表現為耐藥。

3 討論

AHPND是近年來導致全球對蝦養(yǎng)殖大規(guī)模減產的重要病害之一，對其疫病病原的準確鑒定是進行后續(xù)病原防控的基礎。本研究從疑似患AHPND臨床癥狀的凡納濱對蝦中分離得到一株細菌，傳統(tǒng)及分子鑒定的方法確定了該菌株為副溶血弧菌。鑒定中所選擇的 groEL基因的聚類分析結果也證實了該基因具有普遍性、保守性及種間變異性的優(yōu)點，可作為弧菌屬細菌分子鑒定的靶基因(Hossain et al, 2012; Hossain et al, 2013; Ahmed et al, 2016)。

表3 菌株20160303005-1的藥物敏感性Tab.3 Antimicrobial susceptibility testing of isolated 20160303005-1

病原菌的血清學特征可為流行病學調查及臨床用藥提供參考。目前，國際上副溶血弧菌多采用基于13種O抗原(菌體抗原)和71種K抗原(莢膜抗原)的血清型分型系統(tǒng)(Ishibashi et al, 2000)。我國臨床副溶血弧菌的血清型主要為 O3:K6、O4:K8、O4:K68和O1:K36等，而水產品中分離的副溶血弧菌主要為O2、O1和O11型等，基于K抗原自身的多樣性，以及抗原檢測方法多是依據臨床菌株的原因，目前水產品中副溶血弧菌的 K抗原很多都無法定型(K untypeable,KUT)(Chen et al, 2016; Xu et al, 2016)。本研究分離到的菌株 20160303005-1的血清型為 O1:KUT，這與Kongrueng等(2015)報道的可引起 AHPND的副溶血弧菌泰國株的血清型一致。目前，我們正對近4年全國蝦類流行病學調查中收集到的 100多株副溶血弧菌的血清型進行分類鑒定工作，以期找到我國蝦類副溶血弧菌致病株的血清型特征。

作為一種食源性致病菌，國內外均有副溶血弧菌引起食物中毒的報道。tdh和 trh基因作為該病原的重要毒力分子標志基因，常用于人源副溶血弧菌致病菌的分子檢測中(Honda et al, 1988)。目前包括本研究在內，國內水產品源副溶血弧菌的tdh和thr基因檢測結果均為陰性。但國外已有蝦源副溶血弧菌的 tdh和thr基因檢測結果為陽性的報道(Sujeewa et al, 2009;Rahimi et al, 2010)，應當引起我國水產品質量監(jiān)測部門的關注。

本研究分離到的副溶血弧菌菌株20160303005-1對凡納濱對蝦具有較強的致病力，浸泡感染實驗中的LD50為7.96×103CFU/ml。當菌液濃度為1.64×103CFU/ml時，對蝦開始出現死亡，且死亡率隨著菌液濃度的提高而顯著增加，當菌液濃度達到1.64×106CFU/ml時，實驗蝦在感染第 5天即達到 100%的死亡率，這與Joshi(2014)和 Soto-Rodriguez等(2015)的研究結果相似，即副溶血弧菌細菌劑量與對蝦死亡率具有相關性，只有當致病副溶血弧菌濃度達到一定值時，才會導致對蝦發(fā)病死亡。AHPND感染蝦表現有明顯的空腸空胃，肝胰腺發(fā)白等特征，病理學觀察結果證實，該菌株可引起凡納濱對蝦的AHPND典型癥狀，諸如肝胰腺小管崩塌，上皮細胞嚴重脫落等(Tran et al,2013; Joshi et al, 2014; Soto-Rodriguez et al, 2015)。Joshi等(2014)報道的該菌株 AP2引物(http://www.enaca.org/modules/library/publication.php?Publication_id=1128)的檢測結果為陽性，但該病原感染凡納濱對蝦后，不引起AHPND的肝胰腺小管上皮細胞嚴重壞死病變，卻可引起小管上皮細胞的崩解，并在E細胞中形成特有的大量空泡等特征。提示 OIE目前關于AHPND病理特征的界定尚待進一步明確。

目前，對蝦AHPND的產生機制是本領域的研究熱點。Lee等(2015)研究發(fā)現，VP-AHPND中均含有一個約69 kb的質粒，該質粒中攜帶有產生AHPND的2個相關毒力蛋白的pirAVP和pirBVP基因，蛋白結構及信息學分析發(fā)現，盡管2個蛋白與昆蟲致病菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)分泌的1種Cry毒素蛋白(Cry insecticidal toxin-like protein)的基因序列同源性很低(＜10%)，但卻在結構上十分相似，提示兩菌株間可能存在一定的關聯性。Lee (2015)還發(fā)現，用重組表達的 PirAVP+PirBVP及 PirBVP蛋白均可引起AHPND的癥狀，據此推測pirBVP可能是引起AHPND的主要致病基因。Lai等(2015)采用免疫印漬法(Western blotting)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)的方法進行了VP-AHPND致病蛋白在對蝦各組織的定位分析及病理學研究，其結果也提示了該病原的單獨的PirBVP蛋白也可引起感染對蝦AHPND的病理癥狀。不同于上述的Pir蛋白與AHPND直接相關的結果，Joshi等(2014)研究發(fā)現，攜帶該質粒卻產生不同于AHPND典型病理特征的弧菌。因此，該2種Pir蛋白在AHPND的產生機制及致病中作用還有待深入研究。攜帶 PirVP基因的質粒也存在水平轉移的可能，繼引起AHPND的副溶血弧菌報道之后，哈維氏弧菌、歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌均帶有該質粒的事實也提示了這種水平轉移存在的可能性(Lee et al, 2015;Kondo et al, 2015; Liu et al, 2015; Dong et al, 2017)，闡釋該質粒/Pir致病基因的致病及其水平轉移的機制，可為該病原的防控提供理論依據。

本研究分離菌株對阿莫西林等 5種藥物表現為耐藥特征，較國內外副溶血弧菌不同株耐藥譜不盡一致的結果，應主要與菌株分離來源及抗生素藥物使用等因素有關，其中抗生素使用所造成的選擇壓力也客觀上促進了耐藥菌株的產生(Lai et al, 2015; Elmahdi et al, 2016; Chen et al, 2016; Bennett, 2008; Freel et al,2013)。本研究分離的耐藥菌株的結果也再次提醒當前水產菌株耐藥及食品安全等問題的嚴重性。近年來，通過生物安保來實現動物疫病的預防與控制的目的已為健康養(yǎng)殖業(yè)所接受，聯合國糧食及農業(yè)組織(FAO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)對生物安保的定義是為了降低病原對水產養(yǎng)殖系統(tǒng)的傳入、定植和擴散的風險，在管理、技術和設施上執(zhí)行的一整套措施(FAO漁業(yè)委員會水產養(yǎng)殖分委員會, 2010; OIE,2015)。黃倢研究團隊在 OIE和國內生物安保概念的發(fā)展和應用推廣中做出了引領性的工作，該理念所提倡的包括疫病防控在內的與水產養(yǎng)殖健康相關的各種措施的集成來保障水生生物的健康養(yǎng)殖(黃倢等,2016)，有望克服當前水產養(yǎng)殖業(yè)中，因針對各類病害被動防控的藥物使用，所帶來的諸如食品安全、環(huán)境惡化及耐藥菌株等系列問題。相信水產生物安保的推廣實施，可有效保障我國水產健康養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，也應成為今后水產養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的理論基礎。

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