曼氏無針烏賊轉錄組微衛(wèi)星特征分析*

管 奧 毋玉婷 陳 宇 孫 揚 祁鵬志 郭寶英

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院 國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心 舟山 316022)

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella)，和大黃魚(Pseudosciaena crocea)、小黃魚(P. polyactis)、帶魚(Trichiurus haumela)并稱為我國東海“四大海產(chǎn)”，是我國重要的海洋漁業(yè)資源。曼氏無針烏賊地理分布范圍較廣，朝鮮西南海岸、日本瀨戶內海沿岸、俄羅斯遠東海和我國沿海及其鄰近海域都有分布(?？姑赖?2008)。其肉味鮮美，蛋白質含量高，營養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟和藥用價值。以曼氏無針烏賊及其性腺為原材料的產(chǎn)品主要有“墨魚干”、“烏魚蛋”等(董正之,1988)。

由于過度捕撈、生境破壞等原因，資源受到嚴重損害，20世紀中后期開始，曼氏無針烏賊資源已無法形成漁汛，自然海域已很難見到野生的曼氏無針烏賊。因此，為了保護曼氏無針烏賊資源，恢復資源量，人工培育烏賊種苗進行增殖放流的工作已經(jīng)陸續(xù)開展。從21世紀初起，本團隊對曼氏無針烏賊做了大量研究工作，如繁殖習性及產(chǎn)卵場修復(吳常文等,2010)、胚胎發(fā)育與人工育苗技術(?？姑赖? 2009)等，并已解決人工繁育和養(yǎng)殖難題，在 2006～2016年期間，本團隊每年均在曼氏無針烏賊的主要棲息地浙江東極等海域投放百萬頭(顆)幼烏賊和烏賊卵。在放流海域已可見曼氏無針烏賊資源恢復跡象(董智勇等,2010; 史會來等, 2015)，但放流曼氏無針烏賊主要以卵的形式放流，所以傳統(tǒng)的物理、化學等標記方法不完全適用，因此，至今仍不能有效評估增殖放流效果。

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)，是真核生物基因組中的高度重復序列，是由幾個核苷酸組成的串聯(lián)重復序列，其長度一般較短(何平, 1998)。在眾多分子標記中，微衛(wèi)星 DNA(Microsatellite DNA)標記位點數(shù)目巨大且隨機分布于整個基因組中，呈共顯性遺傳，易于檢測且重復穩(wěn)定，在親代和子代之間遵從孟德爾遺傳，因而成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中遺傳多樣性和親緣關系研究的重要分子標記(陳睿毅等, 2013)。目前，微衛(wèi)星標記已經(jīng)應用于頭足綱中的歐洲橫紋烏賊(Sepia officinalis)和真蛸(Octopus vulgaris)的遺傳多樣性研究，及歐洲烏賊(Loligo vulgaris)的遺傳結構研究(Pérez-Losada et al,2002; Moreira et al, 2011; Garoia et al, 2004)。微衛(wèi)星標記對樣本的非損傷性對于一些瀕危珍稀物種而言更是不二選擇，國內外已有將微衛(wèi)星標記應用于漁業(yè)資源增殖放流效果評價的研究(Sekino et al, 2003; 成為為等, 2014)。近年來，利用磁珠富集法和FIASCO法構建微衛(wèi)星富集文庫法，開發(fā)出多對曼氏無針烏賊微衛(wèi)星標記，并利用開發(fā)標記對群體多態(tài)性進行了分析(Wu et al, 2010; 吳璋等, 2011; Guo et al, 2013; 張川等, 2014)，之后鮮見關于曼氏無針烏賊微衛(wèi)星標記開發(fā)的報道。

為進一步開發(fā)可用的微衛(wèi)星標記資源，本研究利用曼氏無針烏賊高通量轉錄組數(shù)據(jù)，獲得127575條Unigene序列。利用計算機軟件進行微衛(wèi)星位點的搜索，并分析微衛(wèi)星序列的特征、分布和組成等信息，為后續(xù)篩選大量的微衛(wèi)星遺傳標記提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及數(shù)據(jù)來源

曼氏無針烏賊視腺轉錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)來自本實驗室，組裝并去冗余后得到127575個Unigene序列，總長度103104058 bp。

1.2 簡單重復序列(SSR)的分析搜索

為檢測曼氏無針烏賊轉錄組中 SSR位點，利用Perl語言操作平臺下的MISA軟件(MISA- MIcroSAtellite identification tool, MISA)(Lu et al, 2013)搜索 Unigene中的 SSR位點，搜索參數(shù)分別設置為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重復次數(shù)分別為6、5、5、4、4。復合SSR 2個位點間最大間隔堿基數(shù)為(Maximal number of bases interrupting two SSRs in a compound microsatellite) 100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將Perl語言操作平臺下的MISA軟件生成的結果MISA文件和STATISTICS文件導入Excel，利用高級篩選功能對結果進行細化和匯總分析，分析 SSR類型、數(shù)目、序列長度、出現(xiàn)頻率和分布情況。用SSR出現(xiàn)頻率及分布的平均距離、重復類型、基元組成等，分析曼氏無針烏賊轉錄組SSR的分布特征，其中，

SSR出現(xiàn)頻率=搜索到的 SSR數(shù)量/總 Unigene序列數(shù)量；SSR發(fā)生頻率=含SSR的Unigene數(shù)/Unigene總數(shù)；SSR分布的平均距離=總Unigene長度/搜索到的SSR數(shù)量。

利用SPSS軟件計算微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率與序列長度的皮爾遜(Pearson)相關系數(shù)。顯著性檢驗的水平定義為P≤0.05，差異顯著；P≤0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 轉錄組序列中SSR的數(shù)量和分布特點

對127575條Unigene序列進行SSR檢測，共得到62124個SSR(完整型SSR 36813個)，分布在50626條 Unigene序列當中。SSR發(fā)生頻率(含 SSR的Unigene數(shù)/Unigene總數(shù))為39.68%，SSR出現(xiàn)頻率(檢出SSR位點數(shù)/Unigene總數(shù)) 48.70%，平均每16.6 kb含有 1個 SSR位點。其中，25548條 Unigene含有1個以上SSR位點，復合型SSR數(shù)目為22001個。經(jīng)對曼氏無針烏賊轉錄組中不同堿基完整型 SSR進行分析，部分SSR信息見表1。

2.2 轉錄組序列中SSR重復基元的分布

在 62124個曼氏無針烏賊微衛(wèi)星的所有堿基重復類型中，二堿基重復 SSR含量最多，約占總數(shù)的50.27%，其次為三堿基重復SSR(26.13%)、四堿基重復SSR(22.37%)，五堿基和六堿基重復SSR所占比例最少(表 2)。研究發(fā)現(xiàn)，曼氏無針烏賊微衛(wèi)星中共有122種重復基元(motif)。其中，二、三、四、五和六堿基重復基元中在各自重復類型出現(xiàn)頻率最多的分別是(AT/AT)n、(AAT/ATT)n、(AAAG/CTTT)n、(AAAAG/CTTTT)n和(AAAAAG/CTTTTT)n。它們在各自重復基元類型中的比例分別是46.41%、26.58%、77.87%、32.67%和20.61%。

表1 曼氏無針烏賊轉錄組中微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫的部分結果Tab.1 SSR database of S. japonica transcriptome

表2 曼氏無針烏賊轉錄中不同微衛(wèi)星重復基元(motif)出現(xiàn)的頻率Tab.2 Occurrence frequency of different microsatellites motifs of S. japonica transcriptome

在曼氏無針烏賊微衛(wèi)星序列 122種堿基重復模式中，二、三、四、五及六堿基重復基元分別有4、10、28、45和35種。從每種重復基元在總SSR(62124)所占的比例來看，所占比例最高的是(AT/AT)n(23.33%)，其次為(AAAG/CTTT)n(17.42%)、(AC/GT)n(16.30%)、(AG/CT)n(10.61%)、(AAT/ATT)n(6.94%)和(AAG/CTT)n(6.46%)等。不同類型重復基元SSRs占總SSR的比例分布見圖1。

圖1 基于重復基元(motif)類型的微衛(wèi)星分布(考慮到堿基互補作用)Fig.1 Microsatellites distribution on different repeat motifs (considering sequence complementary)“其他”表示頻率小于0.50%的重復基元類型“Other motifs” denoted the repeat motifs with frequency below 0.50%

2.3 微衛(wèi)星的長度分布

曼氏無針烏賊轉錄組中所發(fā)現(xiàn)的 36813個完整型微衛(wèi)星中，微衛(wèi)星長度存在極顯著變異，片段長度從12～147 bp不等，平均長度為25.87 bp。曼氏無針烏賊微衛(wèi)星序列中，主要是重復長度大于20 bp的長重復序列，長度在20 bp以上的有18774條，達到微衛(wèi)星(完整型)總數(shù)的51%；而重復長度小于20 bp的短重復序列僅占微衛(wèi)星(完整型)總數(shù)的49%，其中，長度在12～15 bp的數(shù)量略多，長度在16～20 bp之間的次之(圖2)。此外，片段長度在20 bp以上的低級重復基元(二、三核苷酸重復基元)占20 bp以上SSR(完整型)總數(shù)的36.78%，共計13539條。本研究利用SPSS軟件進行Pearson相關性分析表明，曼氏無針烏賊微衛(wèi)星的出現(xiàn)頻率和微衛(wèi)星的長度呈極顯著負相關(P＜0.01)，相關系數(shù)為–0.594。

曼氏無針烏賊轉錄組中微衛(wèi)星數(shù)量與片段長度的分布關系如圖3所示。從圖3可以看出，曼氏無針烏賊 SSR數(shù)量隨著重復次數(shù)的增加呈明顯下降趨勢。二堿基重復隨重復次數(shù)的增加，SSR數(shù)量開始直線下降，當重復次數(shù)從10次增加到11次時，曼氏無針烏賊SSR數(shù)量陡然增加，之后繼續(xù)下降，速率趨于平緩。三堿基重復SSR數(shù)量則一直隨重復次數(shù)增加而減少。當二堿基重復次數(shù)達到11次、三堿基重復次數(shù)達到9次、其他堿基重復次數(shù)達到12次時，SSR的下降速率降低趨于平緩，下降速率較為穩(wěn)定。

圖2 曼氏無針烏賊轉錄組中微衛(wèi)星的長度分布Fig.2 Length distribution of microsatellites in S. japonica transcriptome

圖3 曼氏無針烏賊轉錄組中SSR數(shù)量隨重復次數(shù)的變化Fig.3 Variation of repeat times on number of microsatellites in S. japonica transcriptome“其他”表示四、五、六堿基重復SSR的總和“Others” denoted the total of Tetra-, Penta-, and Hex- nucleotides repeats

3 討論

本研究基于對曼氏無針烏賊轉錄組進行測序所得數(shù)據(jù)，使用MISA軟件對127575個Unigene進行微衛(wèi)星特征分析，共發(fā)現(xiàn)62124個微衛(wèi)星位點，分布在50626條Unigene序列中。SSR的發(fā)生頻率(含SSR的Unigene數(shù)/Unigene總數(shù))為39.68%，平均間隔16.6 kb出現(xiàn)1個SSR序列。不同物種間微衛(wèi)星的出現(xiàn)頻率不同且差異較大，曼氏無針烏賊視腺組織轉錄組中微衛(wèi)星位點出現(xiàn)頻率達到 48.70%，遠大于茶樹花(Camellia sinensis)(16.66%)、野三七(Panax vietnamensis var. fuscidiscus)(16.82%)、油松(Pinus tabulaeformis)(2.23%)(王麗鴛等, 2014; 李翠婷等,2014; 安俊等, 2016)等植物；溝眶象(Eucryptorrhynchus chinensis) (10.36%)、粘蟲(Mythimna separate) (1.93%)、小胸鱉甲(Microdera punctipennis)(7.94%)等昆蟲動物(武政梅等, 2016; 胡艷華等, 2015;庫爾班·吐松等, 2017)和中華鱉(Pelodiscus sinensis)(22.3%)、諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobius chulae)(12.97%)、黃姑魚(Nibea albiflora Richardson)(39.30%)等水生生物(Wang et al, 2013; 蔡磊等, 2015;龔詩琦等, 2016)。與其他軟體動物，如馬氏珠母貝(Pinctada martensii)(13.34%)、縊蟶(Sinonovacula constricta)(8.89%)、蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)(3.69%)(王忠良等, 2015; 劉博等, 2012; 李云峰等,2010)等相比，本研究SSR出現(xiàn)頻率也較高，說明曼氏無針烏賊視腺組織轉錄組 SSR數(shù)量非常豐富。分析其中的原因，一方面，搜索 SSR位點時，不同的搜索軟件、搜索參數(shù)的設置和序列數(shù)據(jù)量大小等都可能對研究結果產(chǎn)生影響。不同物種的物種特異性可能是最根本的原因(黃海燕等, 2013)。

本研究發(fā)現(xiàn)，曼氏無針烏賊微衛(wèi)星序列的重復類型中，二堿基重復類型的數(shù)量最高，約占總數(shù)的50.27%；三堿基重復類型的數(shù)量次之，約占總數(shù)的26.13%。這與草魚(Ctenopharyngodon idellus)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)等以二堿基重復為主的水生生物相同(李偲等, 2011; 崔建洲等, 2006)。也有水生生物，如翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)、縊蟶等以三堿基重復為主(袁文成等, 2015; 劉博等, 2012)。造成以上差異的原因除了物種特異性的差異之外，與搜索SSR軟件的不同和搜索 SSR參數(shù)的設置也有很大關系(Wei et al, 2011)。

SSR分子標記多態(tài)性的高低是判斷其潛在利用價值的重要依據(jù)，而其長度大小是決定標記多態(tài)性高低的關鍵(李珊等, 2010)。當SSR長度≥20 bp時，多態(tài)性較高；當12＜SSR長度＜20 bp時，SSR呈中度多態(tài)性；當 SSR長度＜12 bp時，SSR呈低多態(tài)性(Temnykh et al, 2001)。本研究在SSR篩選設置參數(shù)時，已將長度在12 bp以下的SSR序列篩除，發(fā)現(xiàn)曼氏無針烏賊轉錄組中完整型SSR長度在12～147個堿基之間，平均長度為25.87個堿基。在36813個完整型SSR中，片段長度在12～20 bp之間的SSR有18039條(占SSR總數(shù)的49%)，具有中等多態(tài)性；而片段長度≥20 bp的SSR有18774條(占SSR總數(shù)的51%)，此類 SSR具高度多態(tài)性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，片段長度在20 bp以上的低級重復基元(二、三核苷酸重復基元)占20 bp以上SSR總數(shù)的36.78%，比例較大，共計13539條。由此可見，曼氏無針烏賊轉錄組來源的SSR具有較高的多態(tài)性潛能，在開發(fā)曼氏無針烏賊微衛(wèi)星分子標記研究方面將具有較高的利用價值(楊華等, 2011; Dreisigacker et al, 2004)。利用SPSS軟件進行Pearson相關性分析，發(fā)現(xiàn)曼氏無針烏賊微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率和其長度呈極顯著負相關(P＜0.01)，相關系數(shù)為–0.594。模擬分析研究得出，微衛(wèi)星重復單位長度與選擇壓力相關，經(jīng)受的選擇壓力越小，重復次數(shù)越多；經(jīng)受的壓力越大，重復次數(shù)越少(Samadi et al,1998)。郭文久(2004)分析了 29個真核生物基因組微衛(wèi)星真實統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算發(fā)現(xiàn)，二者相關系數(shù)r=–0.304007852，概率值 P=1.31967×10?28，小于 0.01，驗證了Samadi等(1998)的結果。發(fā)現(xiàn)重復motif長度越長，重復次數(shù)越少，說明不僅在曼氏無針烏賊基因組微衛(wèi)星序列中，微衛(wèi)星序列會隨著重復motif長度的增加，重復次數(shù)顯著減少，在大部分真核生物基因組微衛(wèi)星序列中也是如此。

4 結論

本研究利用高通量測序技術首次對曼氏無針烏賊視腺組織轉錄組進行測序，對 Unigene序列進行SSR檢索，共查找到62124個SSR (36813個完整型SSR)位點，分布在50626條Unigene序列中。SSR重復類型主要以二堿基重復為主，其次為三堿基和四堿基重復。曼氏無針烏賊 SSR序列中，主要為重復片段長度大于20 bp的長序列微衛(wèi)星，占微衛(wèi)星總數(shù)(完整型)的 51%，呈現(xiàn)較高的多態(tài)性。近年來，由于二代測序技術的迅速發(fā)展，使得大批量的測序成為可能，推動基因組學和生物信息學研究的不斷深入，而借助高通量測序技術有關轉錄組微衛(wèi)星方面的研究也逐漸興起。微衛(wèi)星分子標記技術的應用越來越廣泛，但關于曼氏無針烏賊轉錄組微衛(wèi)星的研究仍很少。本研究通過對曼氏無針烏賊視腺組織轉錄組數(shù)據(jù)進行微衛(wèi)星位點的搜索，并分析 SSR特征，研究表明，利用轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘 SSR是高效可行的。研究結果為開發(fā)高多態(tài)性微衛(wèi)星引物來進行曼氏無針烏賊親緣鑒定、放流效果評估、種群遺傳結構、種群遺傳多樣性等研究奠定了基礎。

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