飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚生長、飼料利用率及免疫酶活性的影響*

周朝偉 朱 龍 曾本和 任勝杰李明朔 雷 駱 吳 青

(1. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 402460；2. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系 重慶 402460；3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所 拉薩 850002)

蛋白質(zhì)作為核心營養(yǎng)成分，能夠?yàn)轸~體提供合成蛋白質(zhì)所需的氨基酸，是細(xì)胞、組織和機(jī)體的重要組成部分，同時還作為能量源支持魚體生長和代謝(Jobling, 2012)，是決定魚類生長和發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。飼料中蛋白質(zhì)含量的高低會對魚體生長產(chǎn)生很大影響，飼料中蛋白質(zhì)含量過低，會延緩上市時間，影響經(jīng)濟(jì)效益，同時對魚類的成活率也有一定影響(Eguia et al, 2000)。但是，在飼料中添加過量的蛋白質(zhì)，除增加養(yǎng)殖成本外，過量的蛋白質(zhì)會被魚類通過氧化脫氨基作用分解，產(chǎn)生大量的氨氮排泄物，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖水體污染，不利于生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展(Tibbetts et al, 2000; Yang et al, 2002)。為了保證良好的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效應(yīng)，人工配合飼料中的蛋白水平必須根據(jù)養(yǎng)殖魚類的實(shí)際蛋白需求量進(jìn)行設(shè)定。

本研究以臺灣泥鰍幼魚為對象，通過研究不同蛋白水平對其生長性能、飼料利用率及免疫酶活性的影響，探討臺灣泥鰍幼魚的最適蛋白需求量，為臺灣泥鰍人工飼料的進(jìn)一步研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

本實(shí)驗(yàn)利用 3種不同的蛋白源(魚粉、豆粕和菜粕)和3種不同的糖源(脂肪源、玉米粉和次粉)設(shè)計(jì)出不同蛋白梯度4種等脂等能實(shí)驗(yàn)飼料(25%、30%、35%和40%)。通過60目篩將粉碎后的原料按照上述比例稱重并混勻后，放于–4℃冰箱保存?zhèn)溆谩；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)飼料組成見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)動物購自重慶市榮昌區(qū)祥光泥鰍養(yǎng)殖場，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即用 3%～5%的鹽水進(jìn)行消毒，于1.2 m×0.5 m×0.8 m的水池暫養(yǎng)7 d后，選擇健康、無傷病的臺灣泥鰍幼魚720尾[體重為(8.57±0.35) g]，隨機(jī)分為4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)60尾魚，并分別放入12個水泥池中(1.2 m× 0.5 m×0.8 m)，分別投喂不同蛋白水平的4種實(shí)驗(yàn)飼料。投喂前先將粉料加入少量水充分?jǐn)嚢?，捏成面團(tuán)狀進(jìn)行投喂，每天表觀飽食投喂3次(07:00、12:00和17:00)，投餌1 h后將殘餌及糞便撈出，實(shí)驗(yàn)周期為60 d。養(yǎng)殖期間，每天于17:00～19:00用曝氣后的自來水換水1/3。每天觀察記錄實(shí)驗(yàn)魚的健康狀況以及水質(zhì)、水溫等。養(yǎng)殖期間水溫為 20℃～24℃，pH 為 7.0～7.5，溶氧≥6.0 mg/L。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis, %)

1.3 取樣及粗酶液制備

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行饑餓處理(24 h)，分別從各平行實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取10尾臺灣泥鰍，用MS-222溶液(50 mg/L)麻醉，測定體重后解剖并分離肝胰臟，參照葉元土等(2015)的方法進(jìn)行肝胰臟粗酶液的制備。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)開始時，測定實(shí)驗(yàn)魚的初始體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食1 d，測定各組實(shí)驗(yàn)魚體重，依據(jù)養(yǎng)殖期間飼料的投喂量、飼養(yǎng)時間及實(shí)驗(yàn)前后魚的體重，計(jì)算其特定生長率、蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率、攝食率、飼料效率和成活率。

特定生長率(Specific growth rate，SGR，%/d)=(ln終末體重-ln初始體重)×100/養(yǎng)殖天數(shù)

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio，PER)=(終末體重-初始體重)/蛋白質(zhì)攝入量

式(4)中H為矩陣轉(zhuǎn)置運(yùn)算，該方法要求獲得合路信號理想信號，但北斗系統(tǒng)B1頻點(diǎn)正交支路信號偽碼未知.本文數(shù)據(jù)采樣率為250MHz，每個授權(quán)信號碼片上的采樣點(diǎn)數(shù)n為122.18，利用偽碼碼片寬度恒定的特點(diǎn)，將正交支路信號完整的碼片內(nèi)的采樣點(diǎn)進(jìn)行求和可獲得精準(zhǔn)的授權(quán)偽碼符號，授權(quán)信號一個偽碼周期內(nèi)的偽碼符號求解表達(dá)式如下：

蛋白質(zhì)沉積率(Protein retention efficiency，PRE，%)=100×蛋白質(zhì)增加量/蛋白質(zhì)攝入量

攝食率(Feeding rate，F(xiàn)R，%)=100×攝食量/[養(yǎng)殖天數(shù)×(初始體重+終末體重)/2]

飼料效率(Feed efficiency ratio，F(xiàn)ER)=(終末體重-初始體重)/飼料攝入量

成活率(Survival rate，SR，%)=100×(終末尾數(shù)-初始尾數(shù))/初始尾數(shù)

1.4.2 免疫指標(biāo)的測定 采用磷酸苯二鈉法測定酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)(李影林, 1987)。ACP酶活性單位定義為：以每10 mg肝胰臟組織在37℃與底物作用60 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個酶活力單位(U/mg)。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定肝臟和血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力。采用微量考馬斯亮藍(lán)法測定肝臟蛋白含量，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用連苯三酚自氧化法測定(顧含真等, 2006)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性。SOD活性單位定義為1 g肝組織反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量(U/g)；過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性測定采用高錳酸鉀滴定法測定(孔德勝等, 2012)。CAT酶活性單位定義為每1 g肝組織每1 min分解H2O2的量為1個酶活性單位(U/g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，若組間存在顯著差異，再進(jìn)行Duncan氏進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚生長性能及飼料利用率的影響

飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚生長性能及飼料利用率的影響見表2。隨著飼料蛋白水平的升高，臺灣泥鰍幼魚末重(FW)、特定生長率(SGR)和飼料效率(FER)先上升，飼料蛋白水平≥35%后進(jìn)入平臺期。SGR在飼料蛋白水平為 35%時最大(2.13%/d)；FER則在飼料蛋白水平為 40%時最大(0.98)。蛋白質(zhì)效率(PER)、蛋白質(zhì)沉積率(PRE)和成活率(SR)均呈先升高后降低的變化趨勢，且均在飼料蛋白含量為35%時達(dá)最大值，分別為2.77、44.73%和98.89%。攝食率(FR)則呈逐漸降低的趨勢。FW、SGR和FER的折線模擬結(jié)果(圖1、圖2和圖5)表明，臺灣泥鰍幼魚(8.57 g)達(dá)到最佳生長速度及飼料效率的飼料蛋白水平為34.57%～35.37%。以二次曲線來擬合飼料蛋白水平(x)與 PER(y1)和 PRE(y2)的關(guān)系，得回歸方程 y1= –38x2+25.54x–1.583 (R2=0.8094) ， y2= –724x2+502.12x–43.669(R2=0.8636)，則PER和PRE最高時，飼料蛋白水平分別為33.61%和34.68%。

表2 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚生長性能及飼料利用率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.2 Effect of dietary protein level on the growth and feed efficiency of P. dabryanus ssp (Mean±SD)

圖1 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚增重率的影響Fig.1 Effects of dietary protein level on the final weight of P. dabryanus ssp

圖2 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚飼料系數(shù)的影響Fig.2 Effects of dietary protein level on the specific growth rate of P. dabryanus ssp

圖3 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚蛋白質(zhì)效率的影響Fig.3 Effects of dietary protein level on the protein efficiency ratio of P. dabryanus ssp

2.2 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚肝胰臟免疫酶活性的影響

飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚肝胰臟免疫酶活性的影響見表3。隨著飼料蛋白水平的升高，臺灣泥鰍幼魚肝胰臟超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，且在飼料蛋白為35%時達(dá)最大值，為 118.44 U/g，SOD活性在飼料蛋白為 35%和40%的實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著。肝胰臟過氧化氫酶(CAT)活性隨著飼料蛋白水平升高，呈先升高后降低的變化趨勢，在飼料蛋白含量為35%時達(dá)最大值，為18.01 U/g。肝胰臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)均隨著飼料蛋白水平的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且均在飼料蛋白含量為35%時達(dá)最大值，分別為12.59 U/mg和29.81 U/mg。

圖4 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚蛋白質(zhì)沉積率的影響Fig.4 Effects of dietary protein level on the protein retention efficiency of P. dabryanus ssp

圖5 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚攝食率的影響Fig.5 Effects of dietary protein level on the feeding rate of P. dabryanus ssp

圖6 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚飼料效率的影響Fig.6 Effects of dietary protein level on the feed efficiency ratio of P. dabryanus ssp

表3 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚肝胰臟免疫酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.3 Effect of dietary protein level on the immuno-enzymatic activity of P. dabryanus ssp (Mean±SD)

3 討論

3.1 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚生長性能及飼料利用率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)：隨著飼料蛋白水平的提高，魚類生長先上升后進(jìn)入平臺期，生長曲線符合魚類和飼料蛋白水平之間的生長-劑量關(guān)系(Robbins et al, 1979)。Martínez-Palacios等(2007)研究表明，在飼料中添加適量的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)魚類生長，但過量添加不僅會導(dǎo)致養(yǎng)殖成本的增加，而且魚類會通過脫氨基作用把過量的蛋白質(zhì)消耗。研究顯示，飼料蛋白水平對魚類的生長和飼料的利用效率有顯著影響(劉偉等, 2016;李彬等, 2014)，如在對黑線鱈(Melanogrammus aeglefinus)、墨西哥原銀漢魚(Menidia estor)和短體下眼鲿(Horabagrus brachysoma)的研究中均發(fā)現(xiàn)，魚類生長會隨著飼料中蛋白水平提高先上升后趨于穩(wěn)定(Kim et al, 2001; Martínez-Palacios et al, 2007; Giri et al, 2011)。但徐革鋒等(2016)對細(xì)鱗鮭(Brachymystax lenok)和 Ozório等(2009)對項(xiàng)帶重牙鯛(Diplodus vulgaris)的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的飼料蛋白會抑制魚類生長，出現(xiàn)這種差異的原因可能與魚類的種間特異性、實(shí)驗(yàn)動物的規(guī)格及飼料營養(yǎng)成分不同有關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

魚類攝食是為了滿足自身對能量和營養(yǎng)素的需求，其受飼料蛋白水平的影響(Luo et al, 2005; Wang et al, 2005)。本研究發(fā)現(xiàn)，投喂不同蛋白水平的等能飼料，臺灣泥鰍攝食率隨著粗蛋白含量的增加呈現(xiàn)下降趨勢，這與 Peres等(1999)對舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于本研究采用的是等脂等能飼料，機(jī)體為了滿足對蛋白質(zhì)的需求，低蛋白組魚類通過提高攝食率的方式做出補(bǔ)償性調(diào)節(jié)。

本研究表明，隨著飼料蛋白水平的不斷增加，魚類蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。陳壯等(2014)對鱸魚(Lateolabrax japonicus)研究發(fā)現(xiàn)，飼料粗蛋白水平為45%時，蛋白質(zhì)效率達(dá)到最大，但當(dāng)?shù)鞍姿嚼^續(xù)升高時，蛋白質(zhì)效率顯著下降，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于高蛋白組的非蛋白能量供應(yīng)不足，使一部分飼料蛋白被魚體分解轉(zhuǎn)化為能量，從而導(dǎo)致飼料蛋白質(zhì)效率下降(Santiago et al, 1991)。然而，Lee等(2000)對牙鲆(Paralichthys olivaceus)、Kim等(2005)對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)的研究發(fā)現(xiàn)，隨飼料蛋白水平的不斷增加，蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)顯著降低趨勢(P＜0.05)。張磊等(2016)對達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus)研究發(fā)現(xiàn)，飼料蛋白水平在30%～40%時，蛋白質(zhì)效率并無顯著差異，但當(dāng)飼料蛋白水平從40%增加到50%時，蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與魚的種類和飼料營養(yǎng)成分相關(guān)。

在本研究中，隨著飼料蛋白水平的升高，飼料效率呈逐漸升高的變化趨勢，在飼料蛋白含量≥35%后，逐漸趨于穩(wěn)定。這與星斑川鰈幼魚(丁立云等,2010)和大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)(Lee et al,2003)的研究結(jié)果一致。因此，在魚體內(nèi)添加適宜水平蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)魚體的生長，提高飼料效率，但是當(dāng)添加過量時，會導(dǎo)致魚體生長受阻，蛋白質(zhì)利用效率下降。

3.2 飼料蛋白水平對臺灣泥鰍幼魚肝胰臟免疫酶活性的影響

飼料蛋白水平可在一定程度上影響魚體非特異性免疫功能。SOD和CAT是體現(xiàn)魚類抗氧化能力的重要指標(biāo)，楊弘等(2012)對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高飼料蛋白含量可提高尼羅羅非魚幼魚SOD和CAT。Lee等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，SOD可以通過減弱活性氧自由基對機(jī)體造成的損傷。另外，CAT可以通過催化機(jī)體的H2O2等，生成H2O和O2，從而減輕和防止自由基對細(xì)胞的毒害。本研究發(fā)現(xiàn)，臺灣泥鰍肝臟中 SOD隨著飼料蛋白水平升高呈現(xiàn)先升高后進(jìn)入平臺期的現(xiàn)象，但CAT呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與王美琴等(2009)對半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)和 Mourente等(2002)對金頭鯛(Sparus aurata)的研究結(jié)果類似。

GOT和GPT是衡量機(jī)體肝細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志(張寶龍等, 2015)。在本研究中，隨著飼料蛋白水平的升高，臺灣泥鰍幼魚肝胰臟GOT和GPT活性呈先升高后降低的趨勢。對鯉魚(Cyprinus carpio)、鏡鯉(Cyprinus specularis)、擬目烏賊(Sepia lycidas)的研究均發(fā)現(xiàn)，魚體肝胰臟GOT和GPT均隨飼料蛋白水平升高呈先升高后降低的變化趨勢(鹿璇等, 2014;張寶龍等, 2015; 唐玲等, 2011; 汪元等, 2016)，與本研究結(jié)果一致。在飼料中添加適宜水平的蛋白，可以滿足魚體生長的基礎(chǔ)需要；但當(dāng)添加過量時，會對魚類生長代謝造成影響，從而對肝臟造成損壞，使肝臟中的GOT和GPT流入血液，肝臟中GOT和GPT含量減少。本研究表明，臺灣泥鰍的非特異性免疫功能在一定程度上受到飼料蛋白水平的影響，添加適宜的蛋白水平可以提高魚類機(jī)體的抗病能力。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，適宜的飼料蛋白水平可促進(jìn)臺灣泥鰍幼魚的生長、提高飼料效率、增強(qiáng)免疫酶活性，但過量添加時，會導(dǎo)致魚類生長受阻，蛋白質(zhì)效率、免疫酶活性和成活率下降。綜上所述，考慮到生長性能、飼料利用率及免疫酶活性，臺灣泥鰍幼魚飼料最適蛋白水平為34.68%～35.37%。

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