產(chǎn)硫化氫釀酒酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒品質(zhì)的影響

田秀,許引虎,李惠琳,王玉華,王婧*,王媛,王凱麗

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州， 7300700) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070) 3(安琪酵母股份有限公司 ，湖北 宜昌，443003)

葡萄酒中的含硫化合物一般具有不良的風(fēng)味，如硫化氫、硫醇、硫醚、硫醇酯、含硫雜醇油及雜環(huán)化合物等，這些揮發(fā)性硫化物通常會對葡萄酒的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響[1]。硫化氫(H2S)是影響葡萄酒風(fēng)味的主要揮發(fā)性硫化物，化學(xué)性質(zhì)活躍，通常會通過釀酒酵母的硫代謝產(chǎn)生，具有不愉快的臭雞蛋味、臭鼬味、大蒜味或洋蔥味，會對葡萄酒香氣產(chǎn)生不良影響[2]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，H2S的濃度水平只有每升數(shù)十至數(shù)百微克，但其感官閾值低，刺激作用明顯并難以去除。當(dāng)葡萄酒中的H2S含量達(dá)0.12～0.37 mg/L時(shí)，在品嘗時(shí)就能感覺到其不良的氣味，當(dāng)H2S含量高于0.7 mg/L(以H2SO4計(jì))時(shí)，則葡萄酒往往具有明顯的還原味[1]。在葡萄酒陳釀過程中，H2S可以與一系列的葡萄酒成分反應(yīng)生成其他的硫化物，從而對葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生更廣泛的影響。例如H2S 可以與乙醛或乙醇反應(yīng)形成具有橡膠味的乙二硫醇，而這種低級硫醇因有毒,而有害健康,也會破壞酒的風(fēng)味[3]。因此，釀酒酵母對葡萄酒風(fēng)味的影響復(fù)雜：既可以產(chǎn)生具有花香、果香的高級醇、酯類等物質(zhì)，也可以產(chǎn)生具有臭雞蛋、煮白菜等不良風(fēng)味的硫化物。

在葡萄酒釀造過程中H2S的產(chǎn)生及影響的研究受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[4-10]本研究利用高產(chǎn)，中產(chǎn)及低產(chǎn)H2S的3株釀酒酵母菌株，分別發(fā)酵生產(chǎn)黑比諾干紅葡萄酒，分析3株菌株對黑比諾干紅葡萄酒理化指標(biāo)，H2S生成量，谷胱甘肽含量，香氣物質(zhì)成分及感官品質(zhì)的影響，旨在明確釀酒酵母菌種之間H2S產(chǎn)生量的差異對干紅葡萄酒感官品質(zhì)的影響，并且評價(jià)低產(chǎn)H2S酵母菌在葡萄酒釀造方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料

黑比諾葡萄：2015年9月采自甘肅武威莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司黃羊鎮(zhèn)釀酒葡萄種植基地，含糖量225.43 g/L、含酸量9.5 g/L(酒石酸計(jì))。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

低產(chǎn)H2S釀酒酵母菌株D01：由安琪酵母股份有限公司贈送；中產(chǎn)H2S釀酒酵母菌株Z01：由本實(shí)驗(yàn)室篩自甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)；商業(yè)釀酒酵母菌株紅佳釀Vintage Red：購于意大利Enartis公司。

YPD培養(yǎng)基(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 試劑

2-辛醇，色譜純，SIGMA-ALDRICH(上海)貿(mào)易有限公司；福林酚顯色劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。均為分析純。

1.3.2 儀器

CP214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器，北京科偉永興儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific公司；法國Dujardin Salleron公司；18100摩爾超純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；TG-WAX氣相色譜柱，美國Thermo Scientific公司；TRACE1310-ISQ 氣相色譜質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 葡萄汁酒精發(fā)酵[11]

黑比諾葡萄經(jīng)除梗破碎后裝罐，同時(shí)加入40 mg/L SO2，1 h后加入20 mg/L果膠酶在5 ℃條件下浸漬48 h后添加濃度為106CFU/mL供試釀酒酵母，并按10%的接種量接入葡萄汁啟動(dòng)酒精發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在25～27 ℃，當(dāng)含糖質(zhì)量濃度低于4 g/L時(shí)，進(jìn)行皮渣分離，葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈的玻璃罐中，補(bǔ)加40 mg/L SO2，密封貯藏，期間進(jìn)行2次澄清倒灌，每處理重復(fù)3次。

1.4.2 取樣點(diǎn)選擇[11]

發(fā)酵前取樣：將新鮮的黑比諾葡萄除梗破碎后靜置30 min，取50 mL葡萄汁樣品測定所需指標(biāo)；酒精發(fā)酵前期取樣：葡萄汁經(jīng)添加酵母后，取前期發(fā)酵液(殘?zhí)橇?70 g/L左右)50 mL樣品測定所需指標(biāo)；酒精發(fā)酵中期取樣：當(dāng)發(fā)酵醪殘?zhí)橇繛?00 g/L左右時(shí)取50 mL樣品測定所需指標(biāo)；酒精發(fā)酵末期：當(dāng)殘?zhí)橇吭?0 g/L左右時(shí)取50 mL樣品測定所需指標(biāo)；基酒取樣：發(fā)酵結(jié)束后，取樣50 mL測定所需指標(biāo)。

1.4.3 H2S含量測定[1]

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液：稱取對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽0.25 g溶于250 mL 1∶1.5的HCl溶液中。

0.006 mol/L FeCl3的配制：0.324 FeCl3·6H2O溶于1∶10的HCl中并定容至200 mL。

Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取0.375 Na2S·9H2O溶于0.1 mol/L的NaOH溶液中，定容至100 mL，此溶液含H2S 0.500 g/L。

A溶液：取1 mL上述H2S溶液用0.1 mol/L NaOH定容至50 mL，此溶液含10.0 mg/L H2S。

B溶液：取1 mL A溶液用0.1 mol/L NaOH定容至50 mL，此溶液含200 μg H2S。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取10 mL比色管，每管依次加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 200 μg/L的Na2S·9H2O溶液，分別補(bǔ)水稀釋到5 mL，加入0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液1 mL，搖勻，再加入0.006 mol/L FeCl3·6H2O 1 mL，蓋上塞子，搖勻，放置于暗處反應(yīng)10 min，用10 mL以比色皿在670 nm下比色測吸光度，以水加試劑作空白參比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程y=0.000 7x+0.001 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，說明H2S的含量與吸光度值之間有良好的線性關(guān)系。

1.4.3.3 基酒中H2S含量的測定[1]

取澄清的酒樣5 mL，加到10 mL比色管中，加入0.1%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液1 mL，搖勻，再加入0.006 mol/L FeC13·6H2O 1 mL，蓋上塞子，搖勻，放置于暗處反應(yīng)10 min,，以試劑空白作參比，用10 mL比色皿在670 nm下比色，測出吸光度A1。

取5 mL澄清酒樣，加入2 mL 1∶4 HCl，混勻，以蒸餾水5 mL+2 mL 1∶4 HCl為對照，在670 nm下測出吸光度A2。

以(A1-A2)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算S2-的含量。

1.4.4 GSH含量測定[1]

1.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

銅(II)-新銅試劑:稱取0.063 g CuSO4·5H2O，以20～30 mL水溶解，再稱取0.136 g的新銅試劑用8 mL無水乙醇溶解，二者充分混合后以水定容至250 mL，作為顯色劑。

GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g GSH以水溶解定容至100 mL，得到100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取10 mL比色管，每管依次加入0、 0.1、0.2、 0.5、1.0、1.5、2.0 mL 100 mg/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液分別補(bǔ)水稀釋到2 mL，加入1 mL銅(II)-新銅試劑，加水稀釋定容至10 mL，蓋上蓋子，搖勻，穩(wěn)定15 min后，以試劑空白作參比，用10 mL比色皿在456 nm 處測定試液的吸光度，繪制濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程y=0.004 1x+0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，說明GSH的含量與吸光度值之間有良好的線性關(guān)系。

1.4.4.3 基酒中GSH含量的測定[1]

取澄清酒樣1 mL，加入10 mL比色管中，加入1 mL顯色劑，補(bǔ)水定容至10 mL，蓋上蓋子搖勻，穩(wěn)定10 min后以試劑空白(1 mL顯色劑加水定容到10 mL)，用10 mL比色皿在456 nm處測得吸光度A1。

在10 mL比色管中，加入1 mL澄清的酒樣，加水稀釋至10 mL，搖勻，蓋上蓋子，穩(wěn)定15 min后，以水作參比，用10 mL比色皿在456 nm處測得吸光度A2。

以(A1-A2)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH的含量,結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)2。

1.4.5 常規(guī)理化指標(biāo)分析

1.4.5.1 總糖:費(fèi)林試劑滴定法，總酸均參(GB/15038—2006)測定。

1.4.5.2 揮發(fā)酸：蒸餾后滴定測定(參照GB/15038—2006)。

1.4.5.3 酒精度：采用酒精測定儀測定。

1.4.5.4 色度色調(diào)：參照李素岳的方法[12]。準(zhǔn)確吸取酒樣1 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，取稀釋后的酒樣于1 cm光程比色皿中，分別在420，520和620 nm下測定吸光度值，3者之和即為該酒樣的色度值，前兩者吸光度值之比即為色調(diào)值。

1.4.5.5 單寧：參照NY/T 1600—2008將1 mL酒樣用蒸餾水定容至100 mL，然后吸取1 mL樣品溶液分別加入5 mL水、1 mL鎢酸鈉一鋁酸鈉混合溶液及3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液顯色。靜置2 h后，于765 nm波長處測定樣品的吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中單寧含量(y=0.118 8x-0.000 7，R2=0.999 1)。

1.4.5.6 總酚:參照李靜等的方法[13]，略有修改。將1 mL酒樣用蒸餾水定容至100 mL，然后吸取1 mL樣品溶液分別加入5 mL水、1 mL福林酚顯色劑及3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液顯色。靜置2 h后，于765 nm波長處測定樣品的吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中總多酚含量(y=0.102 4x-0.005 8，R2=0.999 3)。

1.4.5.7 總花色苷:參照翦祎等[14]的方法，略有修改。吸取0.5 mL葡萄酒，用pH 1.0的緩沖液定容至10 mL。室溫平衡100 min，以蒸餾水為空白，分別于波長521 nm和700 nm處測定吸光度。用同樣的方法測定樣品在pH 4.5緩沖溶液中的吸光度。按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A=(Aλmax-A700 nm)pH1-(Aλmax-A700 nm)pH4.5；MW=493.2 g/mol(錦葵色素-3-葡萄糖苷)；DF=稀釋倍數(shù)；1，光程，cm；ε=28 000摩爾消光系數(shù)。

1.4.5.8 柔和指數(shù)[15]：按公式(2)計(jì)算

S=A-T-C

(2)

式中：S，酒樣柔和指數(shù)；A，乙醇體積分?jǐn)?shù)，%；T，單寧含量，g/L；C，總酸含量，g/L。

1.4.6 香氣物質(zhì)檢測

1.4.6.1 香氣物質(zhì)提取

取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.4 g NaCl及10 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇(88.2 ppm)加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封并搖勻，將搖勻的樣品放于40 ℃磁力攪拌器中，平衡30 min，插入萃取頭于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min。

1.4.6.2 GC/MS條件

參照馬騰臻等[ 16]方法并略作修改。TG-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣(He)流速1 m L/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～450。

1.4.6.3 定性定量方法[17]

由GC-MS分析所得的樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫檢索比對及資料參考，進(jìn)行定性分析。各成分的含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，按公式(3)計(jì)算，并利用公式(4)計(jì)算氣味活性值(odor activity value，OAV)：

(3)

(4)

1.4.7 感官評定

感官分析根據(jù)(González-Sanjosé,Ortega-Heras, and Pérez-Magario 2009)描述的方法略有調(diào)整[18-19]。使用7分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化，1代表沒有感覺，7代表感覺非常強(qiáng)烈。選擇8名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并具有葡萄酒品鑒資格證的人員，從色澤、酸度、收斂性、圓潤度、香氣、澄清度、甜味等7個(gè)方面品評。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)平行，采用 Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并利用Duncan’s 多重比較在置信區(qū)間 0.05 下對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌株發(fā)酵黑比諾干紅葡萄酒H2S產(chǎn)生量分析

按照1.4.3的方法，分別對3株供試菌株發(fā)酵過程中的H2S產(chǎn)生量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 種酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒硫化氫含量的影響Fig.1 Effects of three yeast strains on the hydrogen sulfide content of Pinot Noir dry red wine注：同一取樣時(shí)間a、b、c表示樣品在0.05水平差異顯著，下同

3株供試菌株在酒精發(fā)酵過程中H2S的產(chǎn)生量出現(xiàn)顯著差異，酒精發(fā)酵過程中H2S產(chǎn)生量均呈現(xiàn)先增長后穩(wěn)定的趨勢?？梢钥闯?，在酒精發(fā)酵過程中H2S主要在發(fā)酵前期生成，并呈現(xiàn)指數(shù)增長，在發(fā)酵中后期呈現(xiàn)緩慢增長，到酒精發(fā)酵結(jié)束，H2S產(chǎn)生量不再增加，并且H2S的產(chǎn)生與菌株關(guān)系密切。

2.2 酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒GSH含量的影響

按照1.4.4的方法，對3株酵母發(fā)酵結(jié)束后基酒中GSH生成量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 三種酵母菌株對黑比諾干紅葡萄酒GSH含量的影響Fig.2 Effect of three yeast strains on GSH content of Pinot Noir dry red wine

谷胱甘肽(GSH)在細(xì)胞代謝過程中均起著抗氧化的作用，由圖2可以看出，3種菌株所得基酒中，GSH含量差異顯著， D01菌株發(fā)酵的基酒中GSH含量最高，為32.90 mg/L； Z01和Vintage Red菌株發(fā)酵的基酒中GSH含量分別為20.79 mg/L和11.29 mg/L，與D01酒樣相比分別降低了12.11 mg/L和21.61 mg/L，Vintage Red菌株發(fā)酵后GSH產(chǎn)生量顯著降低。這可能是由于在葡萄汁進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，GSH能在一定條件下抑制了H2S的產(chǎn)生，GSH積累量越多 H2S 生成量就越少[20]。

2.3 常規(guī)指標(biāo)分析

由表1可知，采用3株釀酒酵母菌株發(fā)酵的酒樣中，酒精體積分?jǐn)?shù)、還原糖含量、揮發(fā)酸含量均符合國標(biāo)GB15037—2006對干紅葡萄酒的規(guī)定，說明3株釀酒酵母菌株都具有良好的酒精發(fā)酵能力。

表1 酒樣的理化指標(biāo)測定Table 1 Three kinds of alcohol samples of physicaland chemical indicators

葡萄酒的色度是評價(jià)葡萄酒外觀一個(gè)重要指標(biāo)，色度值越高，表明葡萄酒的顏色越深；色調(diào)值反應(yīng)葡萄酒黃色與紅色的比值，色調(diào)值較低的酒體其紫紅或?qū)毷t色調(diào)明顯[21]。由表1 可知，3種酒樣中色度值差異顯著，最低的是D01發(fā)酵的酒樣(0.49)，最高的為Vintage Red發(fā)酵的酒樣(0.65)，Z01 和Vintage Red色調(diào)值分別為0.93和0.99，差異不顯著，但低于D01菌株的酒樣(1.18)，這可能是由于3種釀酒酵母菌株細(xì)胞壁對葡萄酒色素吸附作用的不一致導(dǎo)致。ESCOT等人也曾報(bào)道了釀酒酵母菌株之間其細(xì)胞壁對葡萄酒色素吸附性差異較大[22]。

葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)，其含量和比例都將影響葡萄酒的感官品質(zhì)，尤其是對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等具有重要作用[23]。對于總酚和單寧的含量來說，D01發(fā)酵的酒樣中，單寧含量為1.10 g/L，與其他兩個(gè)酒樣相比差異顯著，高出 0.15 g/L。

花色苷是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)，是紅葡萄酒外觀品質(zhì)和感官質(zhì)量的重要決定因素之一，它賦予了葡萄酒新鮮或深沉的顏色[24]。此外，花色苷作為酚類物質(zhì)對葡萄酒口感也起到很大作用。由表1可知3株供試菌株發(fā)酵酒樣中總花色苷含量也出現(xiàn)顯著差異，D01發(fā)酵的酒樣中，總花色苷含量為128.88 mg/L，較其他兩個(gè)酒樣相比分別提升了7.05 mg/L和20.85 mg/L，提高程度差異明顯。

柔和指數(shù)反應(yīng)了葡萄酒的口感，收斂程度和平衡感，是評價(jià)葡萄酒協(xié)調(diào)性的關(guān)鍵參數(shù)。由表1可以看出，D01，Z01及Vintage Red菌株發(fā)酵的酒樣柔和指數(shù)分別為9.25、8.85和9.02，有研究表明，柔和指數(shù)達(dá)到5.0以上的葡萄酒品質(zhì)較好[25]。說明H2S產(chǎn)生量的不同對酒樣柔和度影響不大。

2.4 黑比諾干紅葡萄酒樣的香氣物質(zhì)分析

2.4.1 黑比諾干紅葡萄酒香氣構(gòu)成

經(jīng)過譜庫檢索對比，鑒定出的芳香化合物定性及半定量結(jié)果見表2。

表2 黑比諾干紅葡萄酒香氣成分及含量與香氣成分香氣活性值(OAV)及特征描述Table 2 Ingredients of Hygienic red wine aroma components and content and aroma componentsaroma activity value (OAV) and characterization

續(xù)表2

編號化合物名稱含量(μg/L)D01Z01Vintage Red閾值(μg/L)OAVD01Z01Vintage Red氣味描述醇類B1丙醇313.57±0.05—87.07±0.56\\B2異丁醇85.15±1.3184.40±0.54146.83±0.81\\B3正丁醇10.64±0.2515.87±3.2115.02±3.21150 000<1<1<1草藥、醇味B41-戊烯-3-醇2.56±0.502.66±0.522.69±0.20\\B5正戊醇1 906.17±2.612 564.94±3.382 912.06±2.151 0001.912.562.91辛辣的、青草香B63-甲基-1-戊醇5.74±0.548.42±1.6715.01±0.08\\B7正己醇654.54±2.69585.01±2.89548.47±1.545212.5911.2510.55草本植物、青草味B8葉醇14.46±2.6621.11±1.5311.74±0.66\\B93-乙氧基丙醇28.62±0.16—8.56±0.581000.290.09—輕微的果香B101-辛烯-3-醇4.84±0.46—5.90±0.46\\B11庚醇55.22±0.5830.41±3.2142.87±0.782500.220.120.17檸檬、柑桔B122-壬醇4.57±0.754.10±0.575.66±0.45\\B131-壬醇59.71±0.5947.84±0.8254.50±0.53\\B14異植物醇4.55±1.393.49±0.25—\\B151-癸醇51.87±0.43—39.61±2.455000.1—0.08橙花香B161-十一醇17.44±0.8411.49±0.3021.54±0.93\\B17苯乙醇861.81±0.75588.20±4.9942.49±0.321 1000.760.550.04玫瑰、花粉香B18月桂醇39.11±1.1630.42±2.59—\\B19反式-橙花叔醇6.83±1.973.41±0.125.64±0.03\\B20豆蔻醇16.27±0.287.63±0.23—\\B211-十五醇8.67±0.226.48±0.396.17±0.19\\B221-十六烷醇0.55±0.0315.31±0.53—\\B234-甲基-1-戊醇—2.59±0.216.27±0.21\\B24正辛醇—82.50±3.23ND8000.1——茉莉香、檸檬味B252-十六烷醇—7.25±0.111.43±0.02\\B26異戊醇——19.17±0.24\\B272,3-丁二醇——22.66±0.10120 000<1——黃油、乳酪B28(Z)-6-壬烯-1-醇——12.66±0.27\\B29順-4-癸烯-1-醇——12.61±0.11\\B30十二醇——34.88±1.11\\B31法呢醇—5.39±0.27ND\\B32棕櫚醇——11.57±0.04\\B331-十四醇——6.17±0.10400——0.02蠟香總量4 149.894 128.924 092.98酸類C1乙酸57.36±0.20244.28±0.5096.66±1.3320 000<1<1<1醋酸味C2丙酸11.19±1.75132.46±1.01—8 1000.02<1—脂肪、果香C3丁酸25.51±2.5214.66±0.5210.71±0.042 3000.01<1<1奶酪、酸敗油味C42-甲基己酸43.91±0.5040.08±0.5455.09±0.32\\C5月桂酸214.64±3.13184.65±3.43186.75±0.121 0000.210.180.19干果,金屬,月桂油C6二十碳五烯酸0.92±0.024.76±0.84—\\C7辛酸878.20±0.52105.20±2.72817.2±1.321 3540.650.080.6澀味、奶油味C8癸酸164.25±3.31117.25±0.7278.69±0.561 0000.160.120.08酸腐味,脂肪味C99-癸烯酸15.00±0.6110.49±0.918.24±0.041 0000.020.01<1脂肪味C103,7-二甲基-2,6-辛二烯酸2.61±0.06——\\C11反式-2-己烯酸—4.10±2.35—\\C12壬酸—4.97±0.476.15±0.47\\C13香葉酸—2.42±0.172.05±0.77\\C14異戊酸——55.09±0.46\\C15庚酸——7.25±0.47\\總量1 413.59865.321 323.88

續(xù)表2

編號化合物名稱含量(μg/L)D01Z01Vintage Red閾值(μg/L)OAVD01Z01Vintage Red氣味描述醛酮萜稀類D1癸醛—16.16±0.6520.65±0.2610—1.622.07生青味D2大馬士酮34.79±0.3428.03±2.3531.87±0.2065.84.675.31焦糖、椰子D3β-紫羅酮12.17±0.406.65±2.2910.57±0.20\\D42-十五烷酮12.00±0.7513.09±1.11—\\D52-壬銅17.60±1.13——1 2500.01——果香,花香,脂肪味D6月桂醛10.44±0.129.13±0.10—\\D7順-7-十四烯醛—7.34±0.22—\\D82-十五烷酮———\\D92,4-二甲基苯甲醛18.43±0.04——\\D10香葉基丙酮76.75±0.7368.42±0.28—\\D11正十五碳醛——10.73±0.72\\D12α-己基肉桂醛1.12±0.29——\\D13月桂烯1.35±0.282.37±0.071.03±0.02\\D14香茅醇27.87±0.94——400.7——檸檬、柑桔香D15橙花醇10.55±0.598.10±0.249.10±0.203000.040.030.03橙花、玫瑰、檸檬D16α-松油醇—2.24±0.273.49±0.03330—<10.01樟腦味、辛辣味D17芐醇—71.71±0.4875.57±1.22\\D18β-蒎烯—1.03±0.01—\\總量223.07234.27163.01其他類E1丁香酚4.33±0.17——2 176<1<1—山楂E24-乙烯基-2-甲氧基苯酚2.38±0.29——\\E32,4-二叔丁基苯酚—42.85±0.3352.53±0.77200—0.210.26石碳酸味E41,6-二仲丁基苯酚—7.22±0.22—\\E52,6-二叔丁基對甲酚38.25±0.9029.68±0.5936.25±0.19\\總量44.9679.7588.78

注：—，未檢測到香氣成分;，未查到相關(guān)資料。

由表2可知，3種酵母菌釀造的酒樣中共鑒定出105種香氣成分，主要包括酯類34種、醇類33種、酸類15種、羰基化合物(醛和酮)12種、萜烯類6種和酚類5種，分別占檢出組分的32.38%, 31.43%, 14.29%, 11.43%, 5.71%和4.76%。其中D01、Z01、Vintage Red酒樣中各定性檢測出63、72、65種成分，3者共有香氣成分為37種，占總組分的35.23%。

2.4.2 香氣成分比較分析

葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分對葡萄酒感官特征有重要影響，主要由酯類、醇類、醛類、酮類等化合物組成[26]。各香氣成分對葡萄酒的實(shí)際香氣貢獻(xiàn)取決于其氣味活度值(質(zhì)量濃度與閾值的比值，OAV)[27]。

2.4.2.1 酯類物質(zhì)

葡萄酒中的酯類物質(zhì)產(chǎn)生于酵母或細(xì)菌的代謝與葡萄酒陳釀過程中，主要包括乙醇酯、乙酸酯和其他酯類。大多數(shù)酯類可以賦予葡萄酒果香和花香氣味，增加酒體的香氣復(fù)雜性和典型性[28]。本試驗(yàn)的3種酒樣中共檢測出34種酯類物質(zhì)。低產(chǎn)H2S的D01菌株發(fā)酵的酒樣中酯類物質(zhì)有20種，其總的質(zhì)量濃度為3 846.0 μg/L，其中OAV值大于1的酯類有7種，這些酯類成分含量由大到小分別：癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯，這些酯類物質(zhì)均能夠給酒樣增加果香味[28]；中產(chǎn)H2S的Z01菌株處理的酒樣中檢測出酯類物質(zhì)有25種，但其總的質(zhì)量濃度為3 027.02 μg/L，顯著低于D01菌株發(fā)酵的酒樣，其 OAV值大于1的酯類有4種，主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯；Vintage Red處理酒樣中酯類有17種，其總的質(zhì)量濃度為2 702.71 μg/L，其中OAV值大于1的酯類有3種，主要為癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯。由此可以看出，3種菌株釀造的酒樣中酯類物質(zhì)總質(zhì)量濃度差異顯著，D01處理中雖然酯類物質(zhì)種類沒有Z01處理的多，但其總質(zhì)量濃度卻顯著高于其他兩種處理，并且在果香味方面的香氣貢獻(xiàn)也顯著高于其他兩個(gè)處理。

2.4.2.2 醇類物質(zhì)

醇類物質(zhì)是酵母代謝的次級產(chǎn)物之一，主要由發(fā)酵過程中糖代謝、氨基酸脫羧、脫氫產(chǎn)生，是酒中主要香氣物質(zhì)[28]。本研究中，3種酒樣中共檢測出33種醇類物質(zhì)，其中有14種成分3種酒樣中共有。D01菌株發(fā)酵的酒樣中醇類其總的質(zhì)量濃度最高，為4 149.89 μg/L， Z01、Vintage Red發(fā)酵的酒樣中醇類含量差別不大，分別為4 128.92 μg/L、4 092.98 μg/L，這兩種酒樣中主要醇類成分為正戊醇和正己醇，賦予酒體青草味，而D01酒樣中主要醇類成分為正戊醇、正己醇和苯乙醇，其中苯乙醇由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生，具有獨(dú)特的紫羅蘭香、丁香、茴香和玫瑰香味，能夠賦予葡萄酒復(fù)雜香氣[29-30]。

2.4.2.3 酸類物質(zhì)

酸類物質(zhì)大部分來源于酵母菌和乳酸菌代謝的副產(chǎn)物。在3種酒樣中檢測出15種酸類物質(zhì)，其中8種酸類物質(zhì)是3種酒共有的。D01 、Z01及Vintage Red菌株發(fā)酵的葡萄酒樣中酸含量分別達(dá)到1 413.59、865.32、1 323.88 μg/L。當(dāng)酸類物質(zhì)的含量低于閾值時(shí)，對酒的感官質(zhì)量有積極的貢獻(xiàn)，可以使酒中的各種香氣物質(zhì)更加的平衡，可是如果高于閾值就會對香氣帶來負(fù)面影響[31]。此外酸類物質(zhì)還可以與醇類物質(zhì)發(fā)生作用，生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，從而給酒體帶來愉快的香味。在本試驗(yàn)中D01酒樣中酸類物質(zhì)的含量高于其他兩種酵母菌所釀酒樣，且其含量與閾值相比基本上均處于低濃度水平。

2.4.2.4 醛酮、萜烯類及其他化合物

在3種酒樣中檢測到6種酮類、6種醛類，相對含量分別為1.01%～1.58%和0.30%～0.39；帖烯類6種，相對含量為0.41%～1.07%；5種揮發(fā)性酚類物質(zhì)，相對含量為0.46%～1.06。盡管這些物質(zhì)的含量較低，但對酒體依然具有一定的貢獻(xiàn)。如3種酒樣中都檢測到了具有焦糖和玫瑰香氣的β-紫羅酮和大馬士酮，但只有D01酒樣中檢測出了2-壬酮及丁香酚，2-壬酮具有果香、花香、脂肪味，是一種葡萄酒中特殊的物質(zhì)，丁香酚具有山楂的香味，因?yàn)檫@些萜烯類物質(zhì)的感官閾值一般都非常低，所以其OAV很高，他們對總體香氣形成的貢獻(xiàn)不可忽視[32-33]。

2.5 主成分分析

為了直觀地分析3種酵母菌株酒精發(fā)酵后對黑比諾干紅葡萄酒中呈香物質(zhì)的差異，對檢測出各類呈香化合物的含量進(jìn)行主成分分析，相關(guān)矩陣的特征值和貢獻(xiàn)率見表3。主成分1的方差貢獻(xiàn)率為54.62%， 主成分2的方差貢獻(xiàn)率為43.38%，二者累積貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到97.99%，基本上已經(jīng)能反映樣品的風(fēng)味品質(zhì)信息，因此選取前2個(gè)主成分進(jìn)行分析。

表3 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of principalcomponents

由圖3-a可知，D01 、Z01及Vintage Red菌株分別釀造的葡萄酒根據(jù)各香氣成分的得分明顯分為3個(gè)區(qū)域，且3個(gè)酒樣相距都比較遠(yuǎn)。圖3-b為鑒定出的105種香氣化合物載荷圖，因子的載荷系數(shù)反映了酒樣中各揮發(fā)性香氣物質(zhì)對各主成分的影響，相關(guān)系數(shù)越大，說明主成分對該變量的代表性越強(qiáng)。從圖3-b可以看出，辛酸乙酯、庚酸乙酯、2壬銅、己酸異戊酯、大馬士酮、反式-4-癸烯酸乙酯、2-甲基己酸與主成分1高度正相關(guān)，而丁香酚、月桂酸乙酯、異丁酸、葉醇、月桂烯、9-十六碳烯酸乙酯、2-十五烷酮、2,6-二叔丁基對甲酚、乙酸乙酯與主成分1高度負(fù)相關(guān)；十一酸乙酯、癸酸異丁酯、癸酸3-甲基丁酯、2,2,4-3甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、肉豆蔻酸異丙酯、肉桂酸乙酯、1-十六烷醇、4-甲基-1-戊醇、正辛醇、2-十六烷醇、月桂醛、順-7-十四烯醛、芐醇與主成分2高度正相關(guān)，辛酸丙酯、3-羥基丁酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸正丙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丙醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、反式-橙花叔醇、豆蔻醇、1-十五醇、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸、β-紫羅酮、香茅醇、橙花醇與主成分2高度負(fù)相關(guān)。

結(jié)合圖6可知，D01酵母菌釀造的酒樣位于主成分1的右下側(cè)，正己醇、1-十五醇對其有顯著影響，香氣品質(zhì)優(yōu)于Vintage Red和Z01的酒樣。

2.6 感官分析

圖4 感官分析雷達(dá)圖Fig.4 Radar map of sensory analysis

對3株產(chǎn)H2S差異顯著的釀酒酵母菌株發(fā)酵所得的葡萄酒進(jìn)行感官分析，比較酒樣在感官方面的不同。由圖4可知，6種感官指標(biāo)中有3種差異明顯，D01葡萄酒的香氣、收斂性及圓潤度均高于其余兩種酒樣，但是在色澤方面低于其余兩種酒樣。而在酸度、甜味方面3種酒樣差異不大，通過感官評價(jià)，說明低產(chǎn)H2S釀酒酵母菌株D01發(fā)酵后的葡萄酒感官品質(zhì)明顯優(yōu)于中、高產(chǎn)H2S的葡萄酒。

3 結(jié)論

利用低產(chǎn)、中產(chǎn)、高產(chǎn)H2S的3株釀酒酵母菌株D01、Z01、Vintage Red，分別釀造黑比諾干紅葡萄酒，所得酒樣中H2S產(chǎn)生量差異明顯，對3種酒樣中GSH含量的測定結(jié)果表明，GSH生成量與H2S 生成量呈反比關(guān)系。采用HS-SPME和GC-MS聯(lián)用技術(shù)，通過定性和定量相結(jié)合的方法分析3種基酒的香氣成分， 低產(chǎn)H2S的D01菌株發(fā)酵的酒樣中對果香味貢獻(xiàn)較高的酯類物質(zhì)主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯，中產(chǎn)H2S的Z01菌株發(fā)酵的酒樣中香氣貢獻(xiàn)值較大的酯類有4種，主要為癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯；中產(chǎn)H2S的Vintage Red酒樣中香氣貢獻(xiàn)較大的酯類物質(zhì)分別為癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯。3種菌株發(fā)酵酒樣中主要醇類成分為正戊醇和正己醇，賦予酒體青草味。其次，3種酒樣中都檢測到了具有焦糖和玫瑰香氣的β-紫羅酮和大馬士酮，但只有D01酒樣中檢測出了具有果香、花香、脂肪味的2-壬酮和具有山楂香味的丁香酚。通過感官評價(jià)，低產(chǎn)H2S的D01菌株釀造的葡萄酒其香氣、收斂性及圓潤度均高于其余兩種酒樣，但是在色澤方面低于其余兩種酒樣。

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