補(bǔ)加可同化氮對(duì)冰酒發(fā)酵的影響

張雪,郭在力,俞志敏,張平,孫玉梅*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(遼寧太陽(yáng)谷莊園葡萄酒業(yè)股份有限公司，遼寧 遼陽(yáng)，111000)

葡萄中含有糖、有機(jī)酸、氨基酸、酚類、無(wú)機(jī)鹽和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母菌利用這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)、繁殖并代謝，生成具有一定風(fēng)味特性的葡萄酒[1]。葡萄眾多成分中，氮元素作用極其重要，直接影響酵母的細(xì)胞合成和多種物質(zhì)代謝[2-3]。通常情況下，葡萄汁中的可同化氮含量在60～500 mg N/L之間，一般認(rèn)為，完成正常酒精發(fā)酵的可同化氮含量不能低于140 mg N/L[4-5]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，如果可同化氮質(zhì)量濃度不足(小于140 mg N/L)，會(huì)出現(xiàn)發(fā)酵停滯或終止，以及生成H2S等現(xiàn)象；如果可同化氮含量過高(大于450 mg N/L)，則產(chǎn)生一些對(duì)葡萄酒風(fēng)味不利的香氣[6]。當(dāng)可同化氮含量低于140 mg N/L時(shí)需要適量補(bǔ)加可同化氮以保證酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行。

目前，關(guān)于補(bǔ)加氮對(duì)葡萄酒發(fā)酵影響的研究較多[7-8]，但尚未見補(bǔ)加氮對(duì)冰酒發(fā)酵影響的研究報(bào)道。冰酒發(fā)酵的糖濃度較高，研究補(bǔ)加可同化氮對(duì)冰酒發(fā)酵的影響意義重大。本研究以威代爾葡萄汁為原料，通過補(bǔ)加氮源提高可同化氮含量，測(cè)定發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)，研究補(bǔ)加可同化氮對(duì)冰酒發(fā)酵的影響，從而為冰酒生產(chǎn)中補(bǔ)加可同化氮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰葡萄汁：威代爾(Vidal)冰葡萄汁。釀酒酵母：釀酒酵母(活性干酵母)ST。添加劑：氮源(Thiazote?)、果膠酶、偏重亞硫酸鉀、山梨酸鉀，遼寧五女山米蘭酒業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 活性干酵母梯度馴化

ST酵母經(jīng)梯度馴化之后制成種子液，然后接種到冰葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵。馴化方法如下：將1 g ST酵母溶于10 mL無(wú)菌水，38 ℃恒溫水浴培養(yǎng)15 min，每隔5 min輕微攪動(dòng)1次，培養(yǎng)完成后得到一級(jí)活化液；取10 mL稀釋到20 °Brix左右的冰葡萄汁，加入到一級(jí)活化液中，25 ℃恒溫放置1 h，每隔30 min攪動(dòng)1次，培養(yǎng)完成后得到二級(jí)活化液；取20 mL 40 °Brix左右的原始冰葡萄汁，加入到二級(jí)活化液中， 20 ℃恒溫水浴培養(yǎng)2 h，每30 min攪動(dòng)1次。得到40 mL ST酵母種子液。

1.4 冰葡萄酒釀造工藝流程

在裝有750 mL冰葡萄汁的1 L葡萄酒瓶中，分別加入120 mg/L偏重亞硫酸鉀和30 mg/L果膠酶，均接種15 mL ST酵母種子液，每組2個(gè)平行。酒瓶用棉塞封口，于18～20 ℃發(fā)酵48 h后，用發(fā)酵栓取代棉塞。當(dāng)還原糖含量基本保持不變時(shí)，加入320 mg/L偏重亞硫酸鉀和200 mg/L的山梨酸終止發(fā)酵。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 活酵母菌濃度測(cè)定

血球計(jì)數(shù)法[9]。

1.5.2 還原糖含量測(cè)定

DNS法[10]。

1.5.3 可同化氮含量測(cè)定

甲醛值法[10]。

教師在物理教學(xué)中要采取多樣化的教學(xué)方法培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)造性思維，而牢固的基礎(chǔ)知識(shí)使學(xué)生進(jìn)行創(chuàng)新的基礎(chǔ)，只有讓學(xué)生深刻的理解了物理基礎(chǔ)知識(shí)，掌握基礎(chǔ)技能，才能為學(xué)生思考問題、解決問題打下良好的基礎(chǔ)。其次，教師在物理教學(xué)過程中要積極培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力，鼓勵(lì)學(xué)生從不同的角度思考問題，擺脫應(yīng)試教育給學(xué)生帶來(lái)的束縛，通過對(duì)學(xué)生發(fā)散思維的培養(yǎng)，讓學(xué)生的創(chuàng)新能力得到提升。

1.5.4 甘油含量測(cè)定

高碘酸氧化滴定碘法[11]。

1.5.5 揮發(fā)性組分含量測(cè)定

采用外標(biāo)法，測(cè)出待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，并與對(duì)應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定時(shí)，測(cè)出的各組分峰面積對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的樣品組分濃度。

樣品中的揮發(fā)性組分包括乙醇、乙酸、高級(jí)醇和酯類，采用頂空-氣相色譜法(HS-GC)進(jìn)行測(cè)定[12]。

(1)處理?xiàng)l件：向15 mL樣品瓶中加入1.4 g NaCl、轉(zhuǎn)子和7 mL發(fā)酵液，用PTFE墊密封，并置于磁力攪拌器上，在350 r/min條件下攪拌10 min。

(2)色譜條件：頂空進(jìn)樣條件：安捷倫7697A頂空進(jìn)樣器；平衡溫度 90 ℃，定量環(huán)溫度 100 ℃，傳輸管路溫度110 ℃，平衡時(shí)間 30 min，采樣時(shí)間0.5 min。

氣相色譜條件：安捷倫 GC6850氣相色譜儀，安捷倫DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；汽化室溫度 250 ℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣量2 μL。色譜柱初溫40 ℃，穩(wěn)定10 min，以5 ℃/min升至180 ℃，穩(wěn)定 1 min，以20 ℃/min升至230 ℃，穩(wěn)定2 min；空氣流量300 mL/min，氫氣流量 30 mL/min，載氣(氮?dú)?流量10 mL/min，分流比10∶1。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)加可同化氮對(duì)活酵母菌數(shù)量的影響

圖1顯示在發(fā)酵的前2天，補(bǔ)加和不補(bǔ)加氮源組的活酵母菌數(shù)量都逐漸減少?？赡苁且?yàn)楸咸阎械奶呛枯^高，且冰酒發(fā)酵是在低溫下進(jìn)行，酵母菌對(duì)于這樣的環(huán)境不能立即適應(yīng)，需要短暫的適應(yīng)階段，所以發(fā)酵的前兩天活酵母菌數(shù)量減少。之后酵母菌逐漸適應(yīng)環(huán)境并迅速的生長(zhǎng)繁殖，并在發(fā)酵第5天達(dá)到最大生長(zhǎng)。發(fā)酵16 d后，與不補(bǔ)加氮源組相比，補(bǔ)加氮源組的酵母菌活細(xì)胞數(shù)量下降較快，可能是產(chǎn)生了較多有害代謝物所致，WANG等[13]也得到了相同的結(jié)論。

圖1 冰酒發(fā)酵過程中活酵母菌數(shù)變化Fig.1 The change of viable yeast cell concentrations during icewine fermentation

2.2 補(bǔ)加可同化氮對(duì)還原糖利用的影響

圖2顯示發(fā)酵的前2 d，補(bǔ)加和不補(bǔ)加氮源組的還原糖含量變化較小，可推測(cè)期間酵母菌都處于適應(yīng)期。隨著酵母菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)程度不斷提高，開始大量的生長(zhǎng)繁殖，大量的還原糖被酵母菌利用，補(bǔ)加氮源組比不補(bǔ)加氮源組耗糖更快更多，前者在發(fā)酵17 d后還原糖含量基本不變，后者在發(fā)酵第19天之后基本不變?？梢?，補(bǔ)加氮源促進(jìn)了發(fā)酵的進(jìn)行，縮短了發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，2組殘?zhí)呛烤笥?25 g/L，符合冰酒的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 冰酒發(fā)酵過程中還原糖含量變化Fig.2 The change of reducing sugar contents during icewine fermentation

2.3 補(bǔ)加可同化氮對(duì)可同化氮利用的影響

圖3顯示補(bǔ)加和不補(bǔ)加氮源組的可同化氮利用趨勢(shì)大致相同。發(fā)酵前5 d，可同化氮含量大幅度下降至最低點(diǎn)；隨后可同化氮含量趨于穩(wěn)定；發(fā)酵20 d后，可同化氮含量上升。這是由于前期酵母吸收大量含氮物質(zhì)，同時(shí)伴隨著乙醇的生成，乙醇濃度較高時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，細(xì)胞通過關(guān)閉輸送氮源的通道來(lái)防止乙醇的毒害作用[14]，因此，發(fā)酵中期可同化氮含量趨于穩(wěn)定。發(fā)酵后期，一方面是因?yàn)榻湍羔尫帕思?xì)胞內(nèi)的部分氨基酸以維持胞內(nèi)的氧化還原平衡；另一方面，由于酵母菌自溶，胞內(nèi)的氨基酸被釋放出來(lái)，致使可同化氮含量上升，這與CHILDS等人[15]的研究結(jié)果一致。

圖3 冰酒發(fā)酵過程中可同化氮含量變化Fig.3 Assimilable nitrogen contents during icewine fermentation

2.4 補(bǔ)加可同化氮對(duì)乙醇生成量的影響

圖4顯示，與不補(bǔ)加氮源組相比，補(bǔ)加氮源組生成乙醇更快。發(fā)酵20 d后，補(bǔ)加氮源組的乙醇含量基本保持不變，而不補(bǔ)加氮源組乙醇含量仍在增加，此時(shí)，補(bǔ)加氮源組乙醇含量為108.3 g/L，不補(bǔ)加氮源組乙醇含量為97.0 g/L?？梢?，氮源的補(bǔ)充促進(jìn)了乙醇的生成，有利于縮短冰酒的發(fā)酵時(shí)間，更快達(dá)到要求的酒精度。

圖4 冰酒發(fā)酵過程中乙醇產(chǎn)量變化Fig.4 The change of ethyl alcohol contents during icewine fermentation

2.5 補(bǔ)加可同化氮對(duì)甘油產(chǎn)量的影響

酵母菌在高糖環(huán)境中，生成了過量的NADH，對(duì)于厭氧發(fā)酵，通過生成甘油平衡氧化還原電位[6]。圖5顯示甘油的生成集中在發(fā)酵的前期和中期，補(bǔ)加氮源組的甘油生成較快，發(fā)酵14 d后甘油含量基本不變，而不補(bǔ)加氮源組甘油含量在發(fā)酵17 d后基本不變。由圖5也可見，補(bǔ)充氮源不影響冰酒發(fā)酵的甘油最終產(chǎn)量，這與BELY等[16]得出的結(jié)論一致。

圖5 冰酒發(fā)酵過程中甘油產(chǎn)量變化Fig.5 The change of glycerol contents during icewine fermentation

2.6 補(bǔ)加可同化氮對(duì)乙酸產(chǎn)量的影響

圖6顯示從發(fā)酵開始到結(jié)束，補(bǔ)加氮源組始終比不補(bǔ)加氮源組的乙酸產(chǎn)量高。乙酸產(chǎn)量受糖消耗速率的影響，補(bǔ)加氮源加快了糖的消耗，從而加快了乙酸的生成。研究表明，當(dāng)可同化氮濃度較低時(shí)，補(bǔ)加氮源可以減少乙酸產(chǎn)量；當(dāng)可同化氮濃度較高時(shí)，補(bǔ)加氮源會(huì)增加乙酸產(chǎn)量[17-18]。由于本研究的不補(bǔ)加氮源組可同化氮基礎(chǔ)濃度較高，所以補(bǔ)加氮源會(huì)提高乙酸的產(chǎn)量。

圖6 冰酒發(fā)酵過程中乙酸產(chǎn)量變化Fig.6 The change of acetic acid contents during icewine fermentation

2.7 補(bǔ)加可同化氮對(duì)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量的影響

圖7顯示高級(jí)醇的生成主要集中在發(fā)酵的前期和中期，正丙醇、異戊醇和異丁醇含量在發(fā)酵14 d達(dá)到最大值后基本不變；但是，2-苯乙醇含量在發(fā)酵前5天逐漸增加至最高，之后開始下降，可能是由于2-苯乙醇是某些產(chǎn)物的合成的前體物質(zhì)，但尚未見到相關(guān)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)加氮源組的正丙醇、異丁醇和2-苯乙醇含量比不補(bǔ)加氮源組低，TORREA、VILANOVA等[19-20]也得出了相同的結(jié)論。異戊醇是由α-酮戊二酸合成的，補(bǔ)加氮源使糖的消耗量增加，α-酮戊二酸作為糖代謝的中間產(chǎn)物，其生成量會(huì)因糖代謝的加強(qiáng)而增加，最終導(dǎo)致異戊醇含量增加，這與秦偉帥等[21]的研究結(jié)果一致。不補(bǔ)加氮源組的最終高級(jí)醇總量，低于補(bǔ)加氮源組。研究表明，高級(jí)醇的總量小于等于300 mg/L時(shí)，高級(jí)醇的含量越高，葡萄酒的風(fēng)味越復(fù)雜。2組高級(jí)醇總量均低于300 mg/L,因此補(bǔ)加可同化氮對(duì)葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性有益。

圖7 冰酒發(fā)酵過程中高級(jí)醇產(chǎn)量變化Fig.7 The change of higher alcohol contents during icewine fermentation

圖8顯示補(bǔ)加可同化氮提高了除琥珀酸二乙酯以外的其他酯類的產(chǎn)量，這可能與乙酸或乙醇的產(chǎn)量增加有關(guān)。補(bǔ)加可同化氮降低了琥珀酸二乙酯產(chǎn)量，可能是由于作為琥珀酸二乙酯前體物質(zhì)的琥珀酸，其生成量會(huì)受到糖代謝和糖代謝途徑中琥珀酸之前的代謝產(chǎn)物消耗的影響，糖代謝途徑中琥珀酸之前的代謝產(chǎn)物消耗較大，琥珀酸生成量就會(huì)減少，琥珀酸二乙酯的生成量也就隨之降低[20]。補(bǔ)加氮源組的總酯含量比不補(bǔ)加氮源組高，葡萄酒的香氣更強(qiáng)。

圖8 冰酒發(fā)酵過程中酯類產(chǎn)量變化Fig.8 The change of esters content during icewine fermentation

3 結(jié)論

初始糖質(zhì)量濃度426.96 g/L、可同化氮質(zhì)量濃度347.49 mg N/L的威代爾冰葡萄汁，補(bǔ)加0.25 g/L的可同化氮能加快糖消耗，且消耗量提高3.23%，可同化氮的消耗量降低10.03%，乙酸、乙醇、高級(jí)醇和酯類物質(zhì)產(chǎn)量顯著提高，分別提高5.44%、4.65%、9.89%和11.38%，對(duì)甘油生成無(wú)影響。因此，適量補(bǔ)加可同化氮會(huì)影響發(fā)酵過程的參數(shù)變化，可以顯著提高冰酒品質(zhì)。適宜的可同化氮含量本課題沒有研究，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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