稀酸和蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

謝慧,張東,張兆昆,王石磊,毛國(guó)濤,王風(fēng)芹,宋安東*

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州，450002) 2(鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南 鄭州，450006)

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源包括農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢棄物和剩余物(如農(nóng)作物秸稈、谷殼、麩皮、蔗渣等)、林木(軟木和硬木)及林業(yè)加工廢棄物、草類等，是地球上最豐富的可再生資源[1]。目前，我國(guó)每年秸稈資源量約為9億t，潛力巨大，其中僅玉米秸稈就有近4.11億t，占全部秸稈量的43.07%[2-3]。玉米秸稈的主要有機(jī)成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，經(jīng)過(guò)化學(xué)、生物或物理法預(yù)處理，酶解糖化生成葡萄糖，木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，而這些糖可進(jìn)一步用來(lái)生產(chǎn)燃料乙醇、木糖醇、有機(jī)酸、單細(xì)胞蛋白、糠醛、乙酰丙酸等工業(yè)產(chǎn)品[4]。

琥珀酸又名丁二酸，是一種重要的C4平臺(tái)化合物，常用于作為合成通用化學(xué)品的起始原料，在化工、食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[5]，被美國(guó)能源部列為最具潛力的平臺(tái)產(chǎn)品之一[6]。目前，合成琥珀酸的方法主要有化學(xué)合成法、生物轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法，但由于微生物發(fā)酵法具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此，微生物發(fā)酵法成為近年來(lái)合成琥珀酸的一個(gè)重要方法[7]。而以可再生生物質(zhì)資源為原料，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，不僅可以節(jié)約大量的化石資源，而且生產(chǎn)過(guò)程相對(duì)無(wú)污染，對(duì)于緩解環(huán)境污染具有積極的意義。ZHENG等[8]對(duì)玉米秸稈、小麥秸稈和水稻秸稈3種生物質(zhì)資源在堿預(yù)處理?xiàng)l件下生產(chǎn)琥珀酸進(jìn)行了研究，結(jié)果表明玉米秸稈水解液更有利于厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸質(zhì)量濃度可達(dá)到53.2 g/L。LI等[9]對(duì)玉米秸稈和棉稈預(yù)處理后水解液生產(chǎn)琥珀酸進(jìn)行了研究，其中以玉米秸稈水解液為碳源時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量可達(dá)到15.8 g/L。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(ActinobacillussuccinogenesATCC 55618)是1株兼性厭氧菌，能利用多種碳源且在生產(chǎn)琥珀酸時(shí)能夠利用CO2作為碳源，發(fā)酵性能良好[10]，不僅具有較好的工業(yè)前景，而且可以一定程度上緩解地球溫室效應(yīng)。

本課題以玉米秸稈為原料，研究了稀酸預(yù)處理(AT)和蒸汽爆破預(yù)處理(SE)技術(shù)對(duì)酶解糖化過(guò)程的影響，并以二者預(yù)處理水解液為碳源，利用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，為微生物工業(yè)化生產(chǎn)琥珀酸奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料處理及酶解條件

玉米秸稈：取自河南省新鄉(xiāng)市，粉碎至10目，含水率約為7.48%。

取上述玉米秸稈進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為：蒸汽壓力2.0 MPa、保壓時(shí)間150 s，所用設(shè)備為河南正道啟寶環(huán)?？萍加邢薰狙邪l(fā)的工藝試驗(yàn)臺(tái)(QBS-80B型)。將蒸汽爆破后的玉米秸稈75 ℃烘干至恒重備用。

將蒸汽爆破預(yù)處理過(guò)的干玉米秸稈置于300 mL三角瓶中，加蒸餾水至固液比1∶8(g∶mL)并用10 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至(4.8±0.2)，每克干物料分別添加纖維素酶和木聚糖酶20 FPU /g和200 U/g，于48 ℃、150 r/min糖化144 h，每12 h補(bǔ)加1次預(yù)處理物料并補(bǔ)加1次酶，共補(bǔ)加4次。最后，過(guò)濾并收集濾液。

稱取20 g已粉碎的未處理秸稈，按照固液比1∶8(g∶mL)加入1%的稀硫酸于300 mL三角瓶中，于滅菌鍋中121 ℃預(yù)處理1 h。冷卻至室溫后按照以上的酶解條件進(jìn)行處理。

1.2 菌株

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)，保存號(hào)ATCC 55618，中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心。

1.3 糖化液過(guò)柱處理

用D301弱堿性陰離子交換樹(shù)脂100 g上柱，以10滴/min的流速將玉米秸稈水解液經(jīng)過(guò)離子交換柱，并收集液體取樣，檢測(cè)處理前和處理后糖的含量從而計(jì)算糖的損失、抑制物的濃度。

1.4 培養(yǎng)基

(1)琥珀酸放線桿菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖2.5、K2HPO4·3H2O 2.5、胰蛋白胨17、大豆蛋白胨3、NaCl 5、pH 7.5加水定容至1 L。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米秸稈水解液 60、酵母粉 12、玉米漿15、K2HPO43、KH2PO43、NaCl 1、MgCl20.4、CaCl20.4、MgCO340。

1.5 培養(yǎng)方法

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的種子液以10%的接種量，接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL厭氧甁中，再充入300 mL CO2氣體，并用封口膜密封。為了利于傳質(zhì)，將厭氧瓶置于37 ℃搖床中180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)。取發(fā)酵液在室溫下10 000 r/min離心10 min，取上清于-20 ℃留存待測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法

利用高效液相色譜(HPLC，Diodex P680)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物及糖化液。水解糖利用示差檢測(cè)器(RI-101，Shodex)檢測(cè)；有機(jī)酸用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng)為210 nm；色譜柱為AminexHPX-87H(300 mm×7.8 mm)；流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫55 ℃。

琥珀酸產(chǎn)率(%)定義為：每消耗1 g糖所產(chǎn)生琥珀酸的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于兩種預(yù)處理?xiàng)l件水解液成分分析

受木質(zhì)素這種難降解高聚物的包裹和纖維素本身的高度結(jié)晶、難溶性的影響，天然狀態(tài)下的木質(zhì)纖維素水解率很低，必須通過(guò)預(yù)處理技術(shù)破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)、降低纖維素聚合度、增加纖維素的孔隙率和結(jié)構(gòu)松散度，增加酶對(duì)纖維素的可及性，使原料組分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而有利于后續(xù)的酶解糖化[11]。對(duì)玉米秸稈進(jìn)行稀酸預(yù)處理(AT)和蒸汽爆破預(yù)處理(SE)后其組分變化見(jiàn)表1。

表1 不同處理物料的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量及降解率Table 1 Content of cellulose, hemicellulose and lignin of corn stalk after different pretreatments

玉米秸稈經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量均下降，其中半纖維素的降解率最高，達(dá)到55.25%，纖維素降解率為14.44%，木質(zhì)素降解率為8.57%。而經(jīng)過(guò)蒸汽爆破的玉米秸稈半纖維素降解率最高可達(dá)87.97%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于稀酸預(yù)處理，木質(zhì)素降解率為25.31%，而纖維素降解率較低，只有7.92%。因此，與稀酸預(yù)處理相比，蒸汽爆破預(yù)處理可更加完整地保留纖維素，且最大程度地破壞了玉米秸稈中半纖維素與木質(zhì)素。陳洪章等[12]認(rèn)為，蒸汽爆破預(yù)處理分為高溫蒸煮和瞬時(shí)減壓兩個(gè)過(guò)程，兩者共同破壞秸稈的結(jié)構(gòu)，爆破力使木質(zhì)素重新分布，纖維素充分暴露，極大地增加了秸稈的表面積和孔隙度，因此酶解效率提高，結(jié)果見(jiàn)表2。

經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理后酶解糖化液中，葡萄糖與木糖2種組分得率相差較大，比例約為4∶1，而稀酸預(yù)處理組的葡萄糖與木糖得率之比僅為2∶1，這是由于蒸汽爆破后的半纖維素降解過(guò)多所致。且蒸汽爆破組的糖化率比酸預(yù)處理組高，達(dá)到11.78%，總糖質(zhì)量濃度比稀酸預(yù)處理組的糖濃度高出31.62 g/L，表明蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)更適合于獲取高濃度的糖。馬斌等[13]人對(duì)采用4種不同預(yù)處理方式處理的玉米秸稈水解液成分進(jìn)行分析，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。這也充分說(shuō)明了爆破預(yù)處理相對(duì)于稀酸預(yù)處理更為激烈，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素破壞嚴(yán)重，從而使得酶解后水解液中發(fā)酵抑制物濃度較高，最為明顯的是蒸汽爆破組的糠醛質(zhì)量濃度為1.17 g/L，是稀酸預(yù)處理組0.84 g/L的1.39倍，對(duì)應(yīng)的5-HMF為2.14 g/L，是稀酸處理的0.58 g/L的3.69倍，而蒸汽爆破組甲酸為4.21 g/L是稀酸組0.61 g/L的6.9倍、乙酸為7.06 g/L是稀酸組的2.67倍，總酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度都較低，分別為63.69 mg/L和41.35 mg/L。從表2可知，對(duì)于有毒物質(zhì)的去除用水洗及D301處理效果顯著，因此蒸汽爆破預(yù)處理后直接糖化所得的糖化液中發(fā)酵抑制物較多，不利于發(fā)酵，需要做脫毒處理。

表2 兩種預(yù)處理方法酶解后玉米秸稈水解液的組分Table 2 The composition of different pretreatment corn stalk after enzymolysis

注：a:稀酸預(yù)處理過(guò)的秸稈；b:蒸汽爆破預(yù)處理后經(jīng)水洗烘干后的秸稈；c:b中所過(guò)濾出的水；d:蒸汽爆破預(yù)處理秸稈

2.2 基于2種預(yù)處理技術(shù)不同糖濃度對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

糖濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)及代謝有重要影響，琥珀酸等有機(jī)酸均由糖經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化而成。由圖1可知當(dāng)糖質(zhì)量濃度在90 g/L以上，會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)及代謝，這使得糖濃度成為影響琥珀酸產(chǎn)量的主要因素，可能原因是高濃度糖會(huì)形成較高的滲透壓，從而抑制菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體代謝生長(zhǎng)受到影響[14]，同時(shí)對(duì)于高濃度的秸稈水解糖液中含有較高的發(fā)酵抑制物如糠醛、酚類物質(zhì)等，從而抑制菌體的生長(zhǎng)；而較低的糖質(zhì)量濃度琥珀酸產(chǎn)量較低，不利于后期分離濃縮。在80 g/L的起始糖質(zhì)量濃度條件下，AT組擁有最高的琥珀酸產(chǎn)量，達(dá)到28.12 g/L，但其副產(chǎn)物如乙酸等也大量生成，將會(huì)不利于后續(xù)工藝的開(kāi)發(fā)。LIU等[15]已證明間歇性補(bǔ)充糖能夠有效降低抑制物濃度，從而減緩高糖質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。因此，綜合考慮殘?zhí)菨舛群顽晁岙a(chǎn)量，選定60 g/L的初始糖質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

圖1 不同預(yù)處理的初始糖質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Comparison of products formation at different initial concentrations of reducing sugar with different pretreatment

2.2.1 兩種不同預(yù)處理技術(shù)對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

初始糖質(zhì)量濃度為60 g/L，研究?jī)煞N預(yù)處理技術(shù)對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響。如圖2所示，SE組未能產(chǎn)生琥珀酸，主要是發(fā)酵培養(yǎng)基中較多的發(fā)酵抑制物影響了菌體的生長(zhǎng)及代謝[16]。AT組和SE-1組的琥珀酸產(chǎn)量分別為22.69 g/L和25.32 g/L，比純糖組分別降低32.69 %和24.89 %。值得注意的是AT組的甲酸和乙酸產(chǎn)量較高，分別達(dá)到19.4 g/L和13.49 g/L，而其余組甲酸和乙酸含量均較低。可能原因是由于酸預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的某些物質(zhì)改變了碳代謝流向而引起琥珀酸產(chǎn)量降低[17]；或者木糖和葡萄糖比例不同也會(huì)影響代謝流向[18]，促進(jìn)副產(chǎn)物的累積卻抑制了琥珀酸產(chǎn)生；再或者高濃度的硫酸鹽會(huì)嚴(yán)重抑制菌體的生長(zhǎng)并導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)量降低[19]。其次發(fā)現(xiàn)除了SE組外，純糖組的殘?zhí)歉哂诹硗?組，此結(jié)果是由于純糖發(fā)酵產(chǎn)酸量較大，使得發(fā)酵液pH降低不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)導(dǎo)致[20]。因此以秸稈水解液作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸過(guò)程中，由于糠醛、HMF等發(fā)酵抑制物的含量較高，從而抑制了菌體生長(zhǎng)及琥珀酸的產(chǎn)生。

SE-1-汽爆后水洗酶解獲得的糖液，SE為汽爆后直接糖化(下同)圖2 兩種預(yù)處理作用下的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Fig.2 The comparison of two kinds of pretreatment for the fermentation results

2.2.2 D301樹(shù)脂脫毒處理對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

從表2可知，經(jīng)D301樹(shù)脂脫毒處理后的發(fā)酵液成分發(fā)生了較大變化，糠醛、總酚脫除效果明顯，脫除率幾乎達(dá)到100%，并且其他抑制成分也都有所減少。但同時(shí)經(jīng)過(guò)脫毒處理也損失了一部分糖，其中稀酸組的葡萄糖損失了32.22%，而另外2組的葡萄糖損失率較低，僅為20.52%，這可能是由于稀酸組中的抑制物相對(duì)較少引起的。有研究表明水洗也能去除有毒物質(zhì)且效果明顯[21]，本實(shí)驗(yàn)采用水洗浸泡的方式也取得了較好的效果。

SE-T表示SE糖化液用D301樹(shù)脂脫毒處理；SE-1-T表示水洗SE糖化液用D301樹(shù)脂脫毒處理；AT-T表示稀酸糖化液用D301樹(shù)脂脫毒處理圖3 D301樹(shù)脂處理對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響Fig.3 The influence of D301 resin processing for succinic acid fermentation

從圖2和圖3分析中發(fā)現(xiàn)，原本的SE糖化液不能用于發(fā)酵，但經(jīng)D301樹(shù)脂處理后可以進(jìn)行發(fā)酵，且琥珀酸產(chǎn)量為11.79 g/L。而經(jīng)水洗和D301樹(shù)脂結(jié)合處理組的琥珀酸產(chǎn)量為24.97 g/L，與僅水洗處理組的琥珀酸產(chǎn)量相產(chǎn)不大，因此僅用水洗方式脫毒就已能夠到達(dá)相同的效果。然而稀酸處理組與D301樹(shù)脂處理的稀酸組的琥珀酸產(chǎn)量相比，兩者相差不大。

綜上所述，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠耐受一定濃度的有毒物質(zhì)，如糠醛、酚類物質(zhì)等。但從未來(lái)工業(yè)化的角度考慮，AT組的副產(chǎn)物含量較高，琥珀酸產(chǎn)量相對(duì)較少，這些都將不利于后續(xù)琥珀酸提純[22]，SE-1組的副產(chǎn)物量較低，琥珀酸產(chǎn)量相對(duì)較高，因此蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)更有利于琥珀酸的工業(yè)化應(yīng)用。

2.2.3 幾種有毒物質(zhì)處理對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中，糠醛質(zhì)量濃度超過(guò)1.5 g/L時(shí)琥珀酸的產(chǎn)生就會(huì)停止，而HMF質(zhì)量濃度超過(guò)1 g/L時(shí)就會(huì)停止發(fā)酵[23]。從表2可以看出，秸稈水解液中含有大量的甲酸、乙酸、糠醛和HMF，其中甲酸和乙酸同時(shí)又是琥珀酸放線桿菌的代謝產(chǎn)物，采用在純糖培養(yǎng)基中添加不同濃度的抑制物，考察它們對(duì)琥珀酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 有機(jī)酸和醛類物質(zhì)對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響Fig.4 The influence of organic acids and aldehydes for succinic acid fermentation

如圖4-A所示，隨甲酸濃度的增加，琥珀酸產(chǎn)量沒(méi)有太大的變化，而乙酸呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)。但當(dāng)甲酸質(zhì)量濃度高于4 g/L 時(shí)，琥珀酸產(chǎn)生受到抑制，培養(yǎng)基中添加4 g/L的甲酸鈉時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量與對(duì)照組相比下降了9.32%。而隨著培養(yǎng)基中甲酸鈉添加量的增加，甲酸的生成量反而減小，乙酸的生成量增加，當(dāng)甲酸鈉添加量為4 g/L時(shí)，與對(duì)照組相比甲酸的產(chǎn)生量降低了53.62%，乙酸的生成量增加了23.17%。從圖4-B可知隨著乙酸添加量增加到10 g/L以上時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量明顯降低；達(dá)到在20 g/L時(shí)，琥珀酸含量與對(duì)照組相比下降了68.30%，而在5 g/L以內(nèi)對(duì)琥珀酸產(chǎn)量基本沒(méi)有影響。因此在秸稈水解液存在少量的甲酸或乙酸不會(huì)對(duì)琥珀酸的產(chǎn)量產(chǎn)生很大的影響，文獻(xiàn)中也報(bào)道過(guò)在培養(yǎng)基配方中添加有1 g/L的乙酸鈉[24]，對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量影響不大。如圖4-C所示，隨著糠醛濃度的提高，琥珀酸的產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)糠醛添加量為1.2 g/L時(shí)，與對(duì)照組相比琥珀酸產(chǎn)量下降了64.67%，當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度增加到1.5 g/L時(shí)，琥珀酸發(fā)酵停止，與文獻(xiàn)報(bào)道報(bào)道結(jié)果一致，然而當(dāng)糠醛濃度低于0.6 g/L時(shí)對(duì)琥珀酸的產(chǎn)量影響不大。從4-D中可知，隨HMF添加量的增加，琥珀酸產(chǎn)量隨之降低，高于1.2 g/L時(shí)，發(fā)酵停止。當(dāng)添加量為0.9 g/L時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量降低了64.44%。由此可知HMF在相同濃度下對(duì)琥珀酸發(fā)酵的抑制作用強(qiáng)于糠醛，但低于0.3 g/L的質(zhì)量濃度時(shí)不會(huì)對(duì)琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)酸處理和蒸汽爆破預(yù)處理進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明蒸汽爆破預(yù)處理的秸稈更有利于酶解，其還原糖質(zhì)量濃度最高可達(dá)到147.24 g/L，比稀酸預(yù)處理的115.61 g/L高出11.78%。利用D301樹(shù)脂處理各種不同預(yù)處理方式下的抑制物，結(jié)果表明，蒸汽爆破組僅用水洗處理的發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量就能達(dá)到25.32 g/L，此條件對(duì)發(fā)酵抑制物的去除效果已較為明顯，從而節(jié)省了脫毒處理的工業(yè)成本。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌對(duì)水洗汽爆玉米秸稈水解液中的有毒物質(zhì)具有較好的耐受性，并且發(fā)酵效果良好，在起始糖質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量最終為25.32 g/L，產(chǎn)率達(dá)42.2%，與純糖發(fā)酵相比僅降低了24.92%。

4 討論

目前利用纖維水解液進(jìn)行琥珀酸發(fā)酵的研究一般都只集中在化學(xué)預(yù)處理，即酸和堿預(yù)處理。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的秸稈進(jìn)行酶解時(shí)需要大量的酸堿來(lái)中和，造成硫酸鹽濃度過(guò)高，不利于Actinobacillussucinogenes的生長(zhǎng)[18]，這與當(dāng)前的環(huán)保需求不符且后期的糖化效果較差。近年來(lái)蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)快速發(fā)展，因其處理后的秸稈更易酶解，并且具有成本低、能耗少、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。

無(wú)論哪種預(yù)處理方式最終都會(huì)產(chǎn)生或多或少的抑制物，因此需進(jìn)一步的脫毒處理。甲酸和乙酸作為菌體的代謝產(chǎn)物，在純糖培養(yǎng)基中添加這2種物質(zhì)，高質(zhì)量濃度的甲酸和乙酸，即甲酸和乙酸質(zhì)量濃度分別大于6 g/L和10 g/L時(shí)會(huì)影響琥珀酸的發(fā)酵，因此需要篩選出甲酸和乙酸生成量較少的菌株?？啡┖虷MF對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響較大，因此需要對(duì)預(yù)處理秸稈進(jìn)行處理才能使用，但本實(shí)驗(yàn)所用菌株對(duì)糠醛和HMF有一定的耐受濃度，分別為0.9 g/L和0.6 g/L。本研究?jī)H用水洗就可達(dá)到一定的脫毒效果，且對(duì)于本實(shí)驗(yàn)琥珀酸的發(fā)酵影響不是很大，這不僅節(jié)約脫毒的成本，且對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，無(wú)復(fù)雜的操作過(guò)程，能夠更好地用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] YUE Z,TEATER C,LIU Y,et al.A Sustainable pathway of cellulosic ethanol production integrating anaerobic digestion with biorefining[J].Biotechnology & Bioengineering, 2010, 105(6):1 031.

[2] 黃季焜,仇煥廣.我國(guó)生物燃料乙醇發(fā)展的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響及發(fā)展戰(zhàn)略與對(duì)策研究[M].北京:科學(xué)出版社, 2010.

[3] 中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局.中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒2014[Z]．北京：中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社，2014.

[4] BIRGIT K, PATRICK R Gruber, Michael Kamm.Biorefineries-Industrial Processes and Products(Volume 1)[M].Hanburg: Wiley-VCH Verlag GmbH & CoKGaA,2006.

[5] 沈圓圓,陶雪婷,張雅欣,等.大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展, 2017, 7(2):139-143.

[6] CHENG K K, ZHAO X B, ZENG J, et al.Downstream processing of biotechnological produced succinic acid[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012,95(4): 841-850.

[7] 孫廷.放線桿菌發(fā)酵琥珀酸的分離提取工藝優(yōu)化研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[8] ZHENG P, DONG J J, SUN Z H, et al.Fermentative production of succinic acid from straw hydrolysate byActinobacillussuccinogenes[J].Bioresource Technology, 2009,100(8):2 425-2 429.

[9] LI Q, YANG M, WANG D, et al.Efficient conversion of crop stalk wastes into succinic acid production byActinobacillussuccinogenes[J].Bioresource Technology, 2010, 101(9):3 292-3 294.

[10] GUETTLER M V, RUMLER D, JAIN M K.Actinobacillussuccinogenessp.nov.a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen[J].International Journal of Systematic Bacteriology, 1999, 49:207-216.

[11] 康鵬,鄭宗明,董長(zhǎng)青,等.木質(zhì)纖維素蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J].可再生能源, 2010,28(3):112-116.

[12] 陳洪章.纖維素生物技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005

[13] 馬斌,儲(chǔ)秋露,朱均均,等.4種木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法的比較[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2013,33(2):25-30.

[14] 方曉江, 李建, 鄭曉宇, 等.ActinobacillussuccinogenesNJ113產(chǎn)丁二酸過(guò)程中的底物抑制[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào), 2010,10(5):976-980.

[15] LIU Y, ZHENG P, SUN Z, et al.Strategies of pH control and glucose‐fed batch fermentation for production of succinic acid byActinobacillussuccinogenesCGMCC1593[J].Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2010, 83(5):722-729.

[16] 吳昊,姚嘉旻,劉宗敏,等.玉米籽皮稀酸水解液脫毒發(fā)酵制備丁二酸的可行性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2009,25(2):267-272.

[17] HODGE DAVID B, ANDERSSON CHRISTIAN, BERGLUND KRIS A, et al.Detoxification requirements for bioconversion of softwood dilute acid hydrolyzates to succinic acid[J].Enzyme and Microbial Technology, 2009,44(5):309-316.

[18] 劉宇鵬,鄭璞,倪曄,等.碳源對(duì)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響及其代謝使用分析[J].微生物學(xué)通報(bào), 2009,32(9):1 283-1 288.

[19] 姚嘉旻,姜岷, 吳昊,等.稀酸水解玉米芯制備丁二酸[J].生物加工過(guò)程, 2010,8(3):66-72.

[20] 楊卓娜,姜岷,李建,等.不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響[J].生物工程學(xué)報(bào), 2010,26(11):1 500-1 506.

[21] 張南南,賴晨歡,李鑫,等.洗滌模式對(duì)蒸汽爆破玉米秸稈脫毒的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2012, 32(6):32-36.

[22] SONG H, HUH Y S, LEE S Y, et al.Recovery of succinic acid produced by fermentation of a metabolically engineeredMannheimiasucciniciproducensstrain [J].Journal of Biotechnology, 2007, 132(4):445-52.

[23] 黃秀梅,李建,陳可泉,等.利用玉米秸稈水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究[J].中國(guó)釀造,2009,28(6):31-34.

[24] ZHENG P,FANG L,XU Y,et al.Succinic acid production from corn stover by simultaneous saccharification and fermentation usingActinobacillussuccinogenes[J].Bioresource Technology, 2010, 101(20):7 889-7 894.