魚藤酮微球制備及其誘導(dǎo)大鼠帕金森病模型的初步研究*

王英舟 劉梅芳 謝東鋒 張春燕

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病， 其臨床特征主要是靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌張力增高和姿勢平衡性障礙，同時(shí)伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運(yùn)動癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著人口的老齡化，其發(fā)病率逐年上升，60歲以上人群患病率約1%[1-2]。PD發(fā)病機(jī)制目前未明確，其研究模型處在不斷改進(jìn)中。Betarbet等[3]建立的魚藤酮帕金森病大鼠動物模型，具有選擇性多巴胺能神經(jīng)元受損、殘存多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)lewy小體、多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性損傷等一系列帕金森病核心特征，受到帕金森病研究者的廣泛重視。該模型的制作方法有頸靜脈手術(shù)埋泵法[4]，長期低劑量皮下注射法[5-6]等，造模成本高，耗時(shí)長，成功率低，限制了它的應(yīng)用與發(fā)展。

微球是指藥物分散或吸附在高分子聚合物基質(zhì)中形成的微小球狀實(shí)體，具有長效緩釋作用[7]。本實(shí)驗(yàn)采用乳化-溶劑揮發(fā)法，制備魚藤酮微球，并對其質(zhì)量進(jìn)行考查，擬將其應(yīng)用于PD大鼠造模，以期降低動物造模過程中給藥頻率，減小動物造模過程中的死亡率。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Mastersizer 3000粒度儀(英國馬爾文公司)；EM-30PLUS掃描電子顯微鏡(韓國COXEM公司)；XHF-D高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；B11-3型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；SHY-3水浴恒溫振蕩器(金壇普林儀器制造有限公司)。

1.2 藥品與試劑

魚藤酮(陜西帕尼爾生物科技有限公司，批號160101)；乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA7525 4A，美國Lakeshore Biomaterials公司，批號LP733)；PVA(Mw：13000～23000，水解度：87%～89%，美國Sigma-Aldrich公司)；二氯甲烷(北京高純科技有限公司，批號20160722)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，200～250g，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動物房提供，動物許可證號：SCXK(魯)2014-0007，動物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動物福利和動物倫理學(xué)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚藤酮微球的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法[8]制備魚藤酮微球：精密稱取適量魚藤酮和PLGA，加入二氯甲烷，渦旋使之溶解為均勻透明的油相(O)溶液，將油相緩慢加入到含有1%PVA的水相(W)中，在2800r/min轉(zhuǎn)速下通過高速分散器高速剪切2.5min形成O/W型乳液，后加入0.1% PVA水溶液中，繼續(xù)低速攪拌4h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，并固化微球。采用合適篩子收集微球，用純化水洗滌3～5次后，真空干燥，得魚藤酮微球。

2.2 微球形態(tài)、粒度分布檢查

采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微球外觀形態(tài)，并用激光粒度儀測定魚藤酮微球粒徑分布，結(jié)果見圖1、圖2。電鏡掃描結(jié)果顯示微球形態(tài)圓整，表面光滑。粒度測定結(jié)果顯示，魚藤酮微球平均粒徑為9.58μm，徑距為1.15。

圖1 魚藤酮微球掃描電鏡照片(×1000)

圖2 魚藤酮微球粒徑測量結(jié)果

2.3 魚藤酮微球載藥量和包封率的測定

2.3.1色譜條件 色譜柱：C18柱(200mm×4.6mm，5μm)，流動相：乙腈：水為1∶1，檢測波長：290nm，流速：1.0ml·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：100μl。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取魚藤酮適量，配制一系列不同濃度的魚藤酮二甲亞砜溶液。將樣品溶液用微孔濾膜過濾后進(jìn)HPLC測定，以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=51374C+67941(R2=0.9999)，魚藤酮在2.0～120mg·L-1范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.3.3載藥量和包封率的測定 精密稱取魚藤酮微球10mg，溶解到5ml DMSO中，用流動相稀釋定容后，進(jìn)HPLC測定峰面積，并按以下公式計(jì)算載藥量和包封率：

載藥量(%)=微球中藥物重量/微球總重量×100%

包封率(%)=微球?qū)嶋H載藥量/理論投藥量×100%

按照實(shí)驗(yàn)處方工藝，制備3批魚藤酮微球，測得3批微球平均載藥量和包封率分別為40.39%和85.72%。

2.4 魚藤酮微球體外釋放度測定

精密稱取魚藤酮微球適量置于50ml具塞離心管中，加入一定體積的釋放介質(zhì)，渦旋1min后放入37℃、50r·min-1恒溫水浴振蕩器中，分別于1、2、4、6、8、24h和2、3、4、5、6、7d取出離心管，室溫下8000r/min離心3min。取10ml上清液作為供試液，并向原溶液中補(bǔ)充10ml釋放介質(zhì)，渦旋1min后放入振蕩器中振蕩。將供試液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，并計(jì)算累積釋放度。見圖3。

圖3 魚藤酮微球體外釋放曲線

由于魚藤酮難溶于水，因此，魚藤酮微球在pH6.8磷酸鹽緩沖液中的溶解過程極其緩慢，41d累積釋放度仍不及10%，因此，我們參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，將釋放介質(zhì)更改為pH6.8磷酸鹽緩沖液和40%乙醇的混合溶液，在該混合溶液中，魚藤酮微球釋藥平緩，第7天釋藥達(dá)到100%。

2.5 魚藤酮微球體外釋藥機(jī)理探討

為了研究魚藤酮微球的體外釋放規(guī)律，分別按零級釋放、一級釋放、Higuchi方程和Weibull分布模型對體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。見表1。

表1 魚藤酮微球在pH6.8PBS(含40%乙醇)中的體外釋放擬合結(jié)果

體外釋放度結(jié)果表明，魚藤酮微球的體外釋放行為更符合一級釋放規(guī)律。

2.6 魚藤酮微球誘導(dǎo)大鼠PD模型的建立

18只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、微球組和每日注射組，每組6只。實(shí)驗(yàn)周期為28d，給藥方式為頸部皮下注射，劑量為2.5mg/kg/d?？瞻捉M和每日注射組每日固定時(shí)間分別給予生理鹽水和魚藤酮葵花油溶液，微球組于第1、8、15、22天給予微球混懸液。3組大鼠分別于給藥后每隔4d稱重，記錄數(shù)據(jù)見圖4，給藥頻率和死亡情況統(tǒng)計(jì)表見表2。

圖4 3組大鼠的體重變化對比圖

由圖4可知，空白組大鼠體重增長率為28.57%，微球組和每日注射組體重增長率分別為11.20%、8.09%，提示微球給藥方式對大鼠體重增長影響較小。

表2 大鼠PD造模死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)

微球組有1只大鼠于給藥后第3天死亡，每日注射組有2只大鼠分別于給藥后第6日和第8日死亡，由表2可知，微球給藥顯著降低了給藥頻率和造模死亡率。

實(shí)驗(yàn)過程中，給藥的2組大鼠均在給藥后出現(xiàn)動作遲緩、弓背狀姿勢，步態(tài)不穩(wěn)等PD模型的典型特征。本實(shí)驗(yàn)過程中，按陳忻等[9]記分方法，微球組與每日注射組大鼠行為學(xué)記分均在3分以上，因此，進(jìn)一步確認(rèn)本文成功制備PD大鼠模型。

3 討論

魚藤酮是一種常見的線粒體復(fù)合體I抑制劑，具有較強(qiáng)的脂溶性，較易透過血腦屏障，從而具有多巴胺神經(jīng)元的毒性。同時(shí)，魚藤酮對于神經(jīng)元的損傷是一個(gè)緩慢作用過程，能夠使動物產(chǎn)生與帕金森病PD較為相似的癥狀，較好地模擬臨床上PD發(fā)病慢、進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)[10]。因此,被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于制備帕金森病動物模型。

魚藤酮見光易分解。因此，本實(shí)驗(yàn)操作中需盡量避光操作，也有學(xué)者嘗試將其制備成為納米脂質(zhì)體和包合物來提高其穩(wěn)定性，降低毒性并減小個(gè)體差異。本文成功制備了魚藤酮微球，并將其進(jìn)行了PD大鼠造模的初步研究。研究表明魚藤酮微球用于PD大鼠造模可以降低給藥頻率，減小動物死亡率，造模動物出現(xiàn)了PD大鼠的行為學(xué)典型特征。但系統(tǒng)的病理學(xué)以及藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn)還有待于進(jìn)一步研究。

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