液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度分析

羅媛媛，萬偉杰，胡麗芳

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室/江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200)

喹乙醇(Olaquindox)又名喹酰胺醇，是一種具有促生長和廣譜抗菌作用的飼料添加劑[1]。喹乙醇的性質(zhì)不穩(wěn)定，在動物體內(nèi)會迅速代謝，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是代謝最主要的產(chǎn)物之一，被認(rèn)定為指示殘留標(biāo)識物。目前，測定喹乙醇代謝物的方法主要有膠體金免疫層析法[4]、液相色譜法[5-8]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-13]，而有關(guān)喹乙醇代謝物測定的不確定度評定只有一篇水產(chǎn)品的文獻(xiàn)[14]，未見飼料中喹乙醇代謝物測定的不確定度評定研究。

2016年5月31日發(fā)布的正式版《檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》要求檢驗檢測機(jī)構(gòu)要建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序。測量不確定度能對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀真實的評價，給出測量結(jié)果的可信程度[15]。本文通過對SN/T 0197─2014《出口動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[16]進(jìn)行動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留檢測的不確定度評定，希望為實驗室質(zhì)量控制(如產(chǎn)品質(zhì)量臨界值時的判定)提供可靠依據(jù)，同時為檢測其他產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度提供參考，評定方法參照J(rèn)JF 1135─2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[17]和JJF 1059.1─2012《測量不確定度評定與表示》[18]。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

標(biāo)準(zhǔn)品:3-甲基喹噁啉-2-羧酸，氘代3-甲基喹噁啉-2-羧酸甲酯(MQCA_D7)(Sigma公司),純度為(99.00±0.02)%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；其他為分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)Agilent1290-6460 triple quad；氮吹儀(英國PEAK畢克氣體氮吹儀)；日本日立CR22G Ⅲ型高速冷凍離心機(jī)；電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；旋渦混合器MJ-U007；美國色譜科真空固相萃取裝置；pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；均質(zhì)器:轉(zhuǎn)速大于10000 r/min。

1.3 測試過程

1.3.1 前處理方法 稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入8 mL蛋白復(fù)合體溶液，混勻后加入0.3 mL 0.01 g/mL溶液混勻，放置于空氣浴搖床中(47±3) ℃酶解16 h。酶解后的樣品溶液放至常溫，加入20 mL 0.3 moL/L鹽酸溶液，混勻后15000 r/min離心5 min，吸取上清液加入10 mL正己烷渦旋混勻，5000 r/min離心5 min，棄去上層液保留下層液，下層液移入混合型陰離子交換固相萃取柱中，全部樣液流出后用10 mL乙酸鈉甲醇溶液淋洗，溶液全部流出后抽干。依次用6 mL水﹑6 mL 1 mmoL/L氨水-甲醇(v/v=4∶1)溶液和6 mL甲醇淋洗，抽干，最后用3 mL 2%甲酸乙酸乙酯洗脫液(接液)，加入100L內(nèi)標(biāo)，濃縮至干。加入1.00 mL 0.1%甲酸-甲醇(v/v=9∶1)溶液溶解殘渣供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量用甲醇定容，并配制為濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液:用1 mL單標(biāo)線吸量管吸取儲備液1 mL，用甲醇溶解，并定容至10 mL，濃度為100g/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間，配制成濃度為20.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)儲備液:稱取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，并配制成濃度約為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，于-20 ℃冰箱保存。

內(nèi)標(biāo)工作液:根據(jù)需要逐級稀釋內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(4)，配制成濃度為0.1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取10.1 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至10.0 mL，配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液:用1 mL單標(biāo)線吸量管吸取儲備液1 mL，用甲醇溶解并定容至10 mL，濃度為100g/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間，配制成濃度為20.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)提取液:空白樣品，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他操作同1.3.1處理后得到的溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別吸取0、25、50、100、200、500L標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入100L內(nèi)標(biāo)工作液，用樣品空白提取液定容至1.0 mL,分別配成0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 ng/mL濃度系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(表1)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

1.3.3 色譜條件 色譜柱:C18柱，2.6 μm,100 mm×3.0 mm(內(nèi)徑)，或相當(dāng)；流動相:A相0.1%甲酸水溶液、B相0.1%甲酸甲醇溶液，流速:0.2 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5L梯度洗脫條件見表2。

表2 5 μL梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子化模式:電噴霧電離源正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓:3500 V；離子源溫度(TEM):325 ℃；干燥氣溫度:300 ℃；干燥氣流量:5 L/min；霧化氣壓力:400 psi；鞘氣溫度:400 ℃；鞘氣流量:12 L/min。其他參考質(zhì)譜條件見表3。

表3 其他參考質(zhì)譜條件

注:*為定量離子。

1.4 建立數(shù)學(xué)模型

其中，X:試樣中喹乙醇代謝物的含量(g/kg)；C:從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的喹乙醇代謝物的濃度(g/mL)；V:樣品最終定容體積(mL)；m:樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從以上方法可以看出，樣品中喹乙醇代謝物測定結(jié)果不確定度的主要來源于待測物濃度、測量重復(fù)性、回收率、試樣稱量、試樣定容。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 待測物濃度引入的不確定度 待測物濃度分為標(biāo)樣的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合2個部分。標(biāo)準(zhǔn)液的配制包括儲備液的配制、稀釋、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制3個步驟。

(1)儲備液配制過程產(chǎn)生的不確定度u(C-1)

由儲備液配制所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

(2)儲備液稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-2)

儲備液稀釋過程見1.3.2，稀釋儲備液引入的不確定度見表4。

表4 儲備液稀釋過程中引入的不確定度

則稀釋儲備液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-3)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程見表1，配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作液引入的不確定度見表5。

則配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(4)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-4)

分別取5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液重復(fù)測定3次，得到對應(yīng)峰面積A的平均值，擬合成線性回歸方程為A=aC+b(a為截距，b為斜率)，結(jié)果見表6所示。取一陽性樣品，進(jìn)行3次重復(fù)測定，得出平均質(zhì)量濃度C0，其測定結(jié)果見表7。則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度計算過程如下:

表5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的不確定度

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果和不確定度計算

則待測物濃度C引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表7 陽性樣品檢測數(shù)據(jù)

表8 重復(fù)測定結(jié)果和不確定度計算

重復(fù)性引入的不確定度按下列公式計算:

則測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度：

2.2.3 回收率產(chǎn)生的不確定度u(R) 在空白豬肉、牛肉、雞肉、魚肉試樣中各添加0.7g/kg的喹乙醇代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次?；厥章式Y(jié)果如表9所示。

表9 動物源性食品中喹乙醇代謝物加標(biāo)回收率測定結(jié)果和不確定度計算

回收率引入的不確定度按下列公式計算:

則回收率產(chǎn)生的不確定度

2.2.5 待測液定容產(chǎn)生的不確定度u(V) 樣品經(jīng)酶解、凈化、氮氣吹干后用分度吸量管移取1.0 mL流動相溶解殘物，則不確定度計算如下:

(2)溫差引入的不確定度:水的體積膨脹系數(shù)為2.10×10-4/℃，實驗室室溫在±3 ℃之間變動，根據(jù)均勻分布進(jìn)行B類不確定度評定，則溫差引入的不確定度為:

2.3 合成不確定度

綜上所述，則加標(biāo)動物源性食品樣品中喹乙醇代謝物測定結(jié)果合成不確定度計算如下:

=0.077

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

3 結(jié)論

本文通過對標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品測量重復(fù)性、目標(biāo)化合物回收率、樣品稱量、待測液定容等因素的考慮，發(fā)現(xiàn)按SN/T 0197─2014出口動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的測定方法中，測量重復(fù)性和回收率所引入的不確定度最大，其次為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，樣品稱量和待測液定容引起的不確定度可忽略不計。因此，在實際檢測中，可通過增加測定樣品平行樣和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的次數(shù)、保證儀器較高的靈敏度和穩(wěn)定性、提高檢測人員的檢測技術(shù)來降低測量不確定度，從而使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

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